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Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 572 (2023) Citar este artículo

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El ratón de laboratorio ha proporcionado una gran comprensión de los fundamentos de la fisiología del sistema nervioso central de los mamíferos. En los últimos años, se ha hecho posible obtener imágenes de neuronas individuales, glía y células vasculares in vivo mediante el uso de preparaciones fijadas en la cabeza combinadas con ventanas craneales para estudiar las redes locales de actividad en el cerebro vivo. Tales enfoques también han tenido éxito sin el uso de anestesia general, proporcionando información sobre los comportamientos naturales del sistema nervioso central. Sin embargo, aún no se ha desarrollado lo mismo para el ojo, que está en constante movimiento. Aquí caracterizamos una nueva preparación fijada en la cabeza que permite imágenes retinales de óptica adaptativa de alta resolución a nivel de una sola célula en ratones que se comportan despiertos. Revelamos tres nuevos atributos funcionales del ojo normal que la anestesia pasa por alto: 1) Movimiento ocular de baja amplitud y alta frecuencia del ratón que solo está presente en el estado de vigilia 2) El flujo sanguíneo unicelular en la retina del ratón es reducido bajo anestesia y 3) las retinas de ratón se espesan en respuesta a la anestesia con ketamina/xilazina. Aquí mostramos los beneficios clave de la preparación de comportamiento despierto que permite el estudio de la fisiología retiniana sin anestesia para estudiar la fisiología retiniana normal en el ratón.

El ratón de laboratorio es un modelo indispensable para la investigación biomédica debido a su tamaño, accesibilidad, catálogo genético secuenciado y capacidad para modelar aspectos de la enfermedad humana. En particular, ha permitido el estudio de la anatomía y la función del ojo de los mamíferos, que, además del tamaño y la notable falta de fóvea, se parece en muchos aspectos al ojo humano1. Para lograr imágenes retinianas de alta resolución en ratones, generalmente se requiere anestesia para estabilizar la preparación y suprimir el movimiento ocular, lo que hace que las evaluaciones funcionales a nivel celular sean casi imposibles2. Algunos enfoques han demostrado que es posible obtener imágenes de la retina del ratón con sujeción manual3,4; sin embargo, la utilidad de este enfoque es para fines fotográficos de una sola instantánea y no proporciona un eje óptico estable que es esencial para las medidas funcionales.

La administración de anestesia general proporciona una preparación in vivo estabilizada y mitiga el movimiento ocular; sin embargo, también puede alterar la función fisiológica normal, lo que limita la interpretación de las mediciones in vivo, especialmente aquellas en la función del sistema nervioso central (SNC)5,6. Con este fin, los neurocientíficos fisiológicos y del comportamiento han desarrollado preparaciones fijadas en la cabeza para estabilizar el cerebro para electrofisiología y microscopía in vivo7, evitando la necesidad de anestesia. En particular, los estudios han informado varias diferencias neurofisiológicas clave en el estado despierto versus el anestesiado8,9. Otra consecuencia de la anestesia para la investigación de la visión es que elimina el movimiento ocular natural que proporciona contraste espaciotemporal al sistema visual. La supresión del movimiento natural del ojo cambia fundamentalmente la cinética espaciotemporal de la salida de las células ganglionares al núcleo geniculado lateral, el colículo superior y los estudios de la corteza visual en ratones10. También hay informes de que la locomoción en la preparación despierto cambia sustancialmente la respuesta fisiológica de la corteza visual11, aunque los mecanismos no se comprenden completamente. Por lo tanto, dejar intacto el movimiento ocular podría avanzar aún más en la comprensión del comportamiento oculomotor del ratón y, en particular, cómo el movimiento ocular biológico puede afectar e impulsar la fisiología visual básica.

Además de los beneficios de preservar el movimiento ocular y eliminar los factores de confusión de la anestesia, la obtención de imágenes del ratón despierto también puede ayudar a obtener imágenes de la retina en varios aspectos adicionales. En primer lugar, la obtención de imágenes del animal despierto puede prevenir la opacificación óptica de la anestesia prolongada, que ha sido un gran desafío para la obtención de imágenes oculares en el ratón anestesiado12. En segundo lugar, la termorregulación no es necesaria cuando se obtienen imágenes del ratón despierto, lo que ha demostrado tener un impacto en la fisiología homeostática13. Y, por último, el ratón despierto mantiene la claridad normal de los ojos parpadeando y refrescando constantemente la película lagrimal sin necesidad de lentes de contacto o lubricación, lo que podría confundir las condiciones ópticas naturales o de comportamiento14.

Aquí reconocemos muchos beneficios potenciales de estudiar la retina del ratón despierto a alta resolución sin anestesia y superamos varias de las limitaciones anteriores mediante el desarrollo y la caracterización de una preparación restringida para la cabeza para la obtención de imágenes de la retina. Proporcionamos un aparato de código abierto totalmente impreso en 3D para sostener la cabeza del ratón y proporcionar una pupila estable con un cuerpo suspendido sobre un cilindro rotatorio que permite la deambulación libre y la medición simultánea de la velocidad y el comportamiento ambulatorio. Medimos la estabilidad del eje óptico que facilita la obtención de imágenes estructurales y funcionales de la retina de alta resolución. Además, mostramos la utilidad al obtener imágenes del ojo del ratón con una oftalmoscopia láser de escaneo multimodal (SLO) comercial líder y una tomografía de coherencia óptica (OCT). Luego, demostramos los beneficios de las imágenes de alta resolución utilizando un oftalmoscopio de luz de escaneo de óptica adaptativa personalizado (AOSLO) para visualizar varias estructuras celulares de la retina con una resolución de nivel micrométrico. La estabilidad del ojo y la calidad de la imagen en el ratón despierto se validan para imágenes SLO y AOSLO. Mediante el uso de imágenes AOSLO de escaneo lineal de alta velocidad AOSLO15,16, descubrimos un movimiento ocular similar a un microtemblor que antes se había pasado por alto. En este trabajo inicial, mostramos varias oportunidades científicas al destacar tres cambios fisiológicos clave en la retina inducidos por la anestesia.

El enfoque general y la configuración se presentan en la Fig. 1a. El cráneo del ratón se mantuvo estable a través de una placa de cabeza fijada. La placa de cabeza en forma de Y se implantó en el centro del cráneo del ratón en paralelo al eje anteroposterior después de un único corte quirúrgico a través del cuero cabelludo bajo anestesia (Fig. 1b). Todos los ratones sobrevivieron al procedimiento. Los ratones con placas de cabeza exhibieron un comportamiento normal y mantuvieron una apariencia externa saludable con un pelaje arreglado y un nivel de actividad normal. No se observaron inflamación u otros efectos secundarios relacionados con la implantación de la placa de cabeza. Los pesos de todos los ratones también se mantuvieron constantes antes y después de la cirugía. Dentro de los 3 días posteriores a la colocación quirúrgica de la placa de cabeza, los ratones con la cabeza restringida se aclimataron al aparato durante cinco sesiones de entrenamiento que duraron 30 a 60 minutos. La placa de la cabeza en forma de Y se montó en un brazo fijo suspendido sobre un cilindro giratorio de modo que los ratones pudieran deambular libremente de un lado a otro. Después del entrenamiento y la aclimatación en el aparato fijo en la cabeza, los ratones no mostraron aversión ni respuesta de retirada, mantuvieron un comportamiento de aseo normal (video complementario 1), lo que indica además un estado de referencia tranquilo sin signos externos de angustia17,18. La cirugía de placa craneal dejó el ojo abierto con un reflejo de parpadeo normal (Video complementario 1).

una preparación restringida a la cabeza para obtener imágenes de la retina de ratones despiertos y con comportamiento. Una placa de cabeza en forma de Y implantada quirúrgicamente en el cráneo del ratón restringe el movimiento de la cabeza, mientras que se permite la deambulación en un cilindro giratorio durante la toma de imágenes. b Esquema que muestra la posición de la placa de la cabeza en el centro del cráneo del ratón en paralelo con el eje anteroposterior. c Una fotografía del ratón con la cabeza restringida fotografiada con SLO comercial. d Imagen cSLO multimodal de la retina en ratones despiertos con la cabeza restringida. Se visualizan diferentes estructuras retinianas (izquierda - derecha): las imágenes de reflectancia y autofluorescencia revelan los principales vasos sanguíneos retinianos superficiales y haces de fibras nerviosas debajo de los canales NIR (arriba) y azul (abajo). Registro conjunto fluorescente de angiografía con verde de indocianina excitada por NIR (ICGA) de redes de vasos sanguíneos superficiales (representadas como pseudocolor rojo) con células inmunitarias marcadas con fluorescencia excitadas azules (representadas como pseudocolor verde) en un ratón transgénico CX3CR1. ICGA de la red de vasos sanguíneos coroideos profundos. Cubo e OCT y una sección transversal escaneada b representativa en un ratón despierto con la cabeza restringida. f Las imágenes de AOSLO muestran capacidades multimodales. Izquierda: la imagen de reflectancia confocal revela un haz de fibras nerviosas y capilares retinianos. Medio: imagen de contraste de fase de un microquiste y una rama de los vasos sanguíneos de la retina. Derecha: imagen de fluorescencia de una célula ganglionar de la retina marcada con YFP con dendritas y axones resaltados.

El aparato con sujeción a la cabeza permitió obtener imágenes de la retina estructurales y funcionales de alta calidad utilizando plataformas comerciales de imágenes SLO y OCT sin la ayuda de la óptica adaptativa (Fig. 1d, e y Video complementario 3). Todas las principales modalidades de imágenes de fluorescencia, autofluorescencia y reflectancia fueron posibles utilizando el sistema comercial SLO + OCT (Heidelberg Spectralis, Heidelberg Engineering, Alemania). Usando la reflectancia, los principales vasos sanguíneos retinianos superficiales y los haces de fibras nerviosas se revelaron bajo los canales NIR y azul. Los agentes de contraste de angiografía populares también podrían usarse en el ratón despierto para revelar la angiografía con fluoresceína sódica (FA) con imágenes claras de arteriolas, vénulas y capilares de la circulación retiniana usando excitación de 488 nm, así como fluorescencia de paso largo de ~ 500 nm. La angiografía con verde de indocianina (ICGA) utilizando luz NIR reveló tanto la circulación retiniana superficial como demostró una buena penetrancia para visualizar la circulación coroidea. Visualizar la coroides es un desafío notable en el ratón C57BL6/J ya que el EPR está densamente pigmentado. Para mostrar el potencial para obtener imágenes de fluorescencia marcada transgénicamente, también obtuvimos imágenes de microglía fluorescente utilizando ratones CX3CR1 con una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en células que contienen el receptor 1 de quimiocina CX3. En todas las modalidades de imágenes SLO (fluorescencia y reflectancia), el único El contraste de imagen de cuadro y la relación señal-ruido (SNR) fueron suficientes para realizar el registro a una velocidad de cuadro de hasta 8,8 Hz con el software de registro automático incorporado (Video complementario 2). El registro en face permitió el registro B-scan en tiempo real para cubos OCT volumétricos y mejoró la SNR al promediar múltiples imágenes (ART, seguimiento automático en tiempo real)19. Tomamos imágenes de un cubo 3D OCT con 96 escaneos B. Utilizando el registro en tiempo real y ART incorporados, el cubo OCT reveló una clara delimitación de las capas de la retina comparable a la lograda con la anestesia a pesar de los cambios de mirada residuales y el movimiento ocular dentro de la adquisición del cubo completo.

Un desafío importante para las imágenes de alta resolución de la retina del ratón despierto es que el haz de imágenes que entra en la pupila del ojo del ratón (~ 2 mm) es sensible al movimiento de la cabeza y los ojos. Las desalineaciones de las pupilas pueden causar recortes y viñetas que impactan seriamente en la detección del frente de onda, desenfocan la imagen y crean una entrega/recolección de luz inestable para mediciones funcionales. Para la mayoría de las aplicaciones de alta resolución, es deseable una pupila completamente dilatada porque maximiza la apertura numérica (NA ~0.49), mejorando así la resolución de imágenes y la eficiencia de recolección de luz. Sin embargo, también crea un requisito de estabilidad para alinear la pupila óptica del instrumento con la pupila del animal. Para cuantificar la estabilidad del eje óptico para las imágenes de la retina, se tomaron imágenes de la pupila de salida del ojo en cinco ratones despiertos con SLO durante más de 20 min. La pupila fue rastreada y segmentada a partir de las imágenes SLO utilizando un software personalizado (Fig. 2a y Video complementario 3). Se rastreó la pupila del ratón para cuantificar el recorte espacial del haz basado en un haz de imágenes simulado de 2,0 y 1,6 mm de diámetro (Fig. 2b, c). Con el haz de 2,0 mm, cuatro ratones mostraron una excelente estabilidad de la pupila con un área media de la pupila recortada con el tiempo <1 %. Un animal mostró más recorte de haz (6,65%). Encontramos que esto es un caso atípico debido a una cirugía subóptima de placa craneal que dejó una apertura incompleta del ojo debido a una pequeña caída del párpado. Utilizando el haz de imágenes más pequeño de 1,6 mm, todos los ratones mostraron un recorte de haz insignificante, que representa el 0,112 ± 0,18 % del área de la pupila (media ± SD, n = 5 ratones). Para evaluar el impacto temporal del recorte del haz (la fracción de tiempo en que el haz se recortó en >10 %), evaluamos videos SLO capturados a 8,8 fotogramas por segundo (fps). Encontramos que el 94,75 ± 11,13 % de los fotogramas se soltaron para el haz de 2,0 mm (media ± SD, N = 5 ratones) y el 99,78 ± 0,30 % de los fotogramas se soltaron cuando se utilizó un haz de 1,6 mm. La pequeña fracción de recorte de la pupila en el análisis espacial o temporal se atribuyó principalmente al comportamiento de la mirada del ratón más que a la falta de estabilidad de la preparación de la placa frontal. La estabilidad de la pupila también se examinó comparando la posición de la pupila con respecto a la velocidad de la marcha registrada simultáneamente. No hubo correlación entre el recorte del haz o el centrado de la pupila con el comportamiento de locomoción. Esto sugiere que la estabilidad de la pupila se atribuyó a una placa frontal fijada de manera estable (Fig. 2d). Tanto el análisis espacial como el temporal sugieren que la pupila es estable, incluso con una locomoción de hasta 0,8 m/s (aproximadamente ¼ de la velocidad máxima de un ratón sin restricciones). Por lo tanto, la preparación del ojo del ratón despierto se presta favorable para la proyección de imagen retiniana continua que facilita la optofisiología funcional en condiciones más naturales.

a Imagen de la pupila de un ratón capturada con SLO comercial. El círculo sólido amarillo indica el límite de la pupila rastreada del ojo. Los círculos cian sólidos y discontinuos indican, respectivamente, la baliza de imágenes simulada de 2 y 1,6 mm de diámetro de un sistema de imágenes de alta resolución. b El mapeo de la persistencia de la pupila revela una pupila estable durante 20 minutos cuando se utilizan pupilas del sistema de 2 mm (sólidas) y 1,6 mm (discontinuas). c El eje y izquierdo muestra el recorte de la pupila en el área y el eje y derecho muestra la facción de fotogramas sin recortar (<10 % del área) durante la sesión de imágenes de 20 minutos (N = 8956 fotogramas). d No se observó una correlación obvia al correlacionar el movimiento del ojo del ratón y las velocidades de marcha, lo que muestra una estabilidad óptica constante sin importar el estado de deambulación del ratón.

Además del movimiento de la pupila, el movimiento ocular, incluidos los cambios de mirada y los parpadeos, pueden interrumpir los enfoques de imágenes estables. Por lo tanto, cuantificamos el cambio de mirada y el parpadeo al obtener imágenes de la retina con SLO durante 20 minutos en cinco ratones despiertos. En comparación con los humanos, el parpadeo fue mucho menos frecuente en los ratones (1,78 ± 0,8 parpadeos/minuto, n = 5 ratones) en comparación con los humanos (~20 parpadeos/min)20. La duración medida del parpadeo del ojo del ratón fue <340,9 ms, lo que corresponde a aproximadamente tres fotogramas en el sistema SLO. Los raros eventos de parpadeo en el ratón facilitan la obtención de imágenes ininterrumpidas más allá de lo que es posible en las imágenes de la retina humana. Los cambios de mirada se cuantificaron mediante el seguimiento de las características de la retina en un FOV de 55° (8,8 fps). Los ratones vieron libremente la escena visual de la configuración experimental con movimientos oculares poco frecuentes pero dirigidos. Esto se midió sin la orientación de la cabeza ya que el aparato fijo en la cabeza restringía la mirada solo al movimiento del ojo. La mayoría de los cambios de la mirada en la retina estaban en el eje horizontal y abarcaban un rango observado de pico a pico de ±18,00˚ FOV en condiciones de visualización libre. Esto fue grande en comparación con ± 3.44˚ de seguimiento de movimiento en la dimensión vertical (Fig. 3a y Video complementario 3). Al igual que en estudios previos21, encontramos que los cambios de mirada predominantes eran >5˚, rápidos (~50˚/s) y raros (~7 por minuto en ratones, en comparación con múltiples movimientos sacádicos por segundo en humanos). Como los ratones carecen de fóvea, estos cambios de mirada no son verdaderos movimientos sacádicos que vuelven a centrar la imagen en la fóvea22, sino que pueden representar una redistribución de la escena visual en áreas más densas con fotorreceptores o campos receptivos de células ganglionares más pequeños que residen cerca del eje óptico. del ojo23. Veinte minutos de seguimiento de video semicontinuo de la retina del ratón, el comportamiento de la mirada mostró un patrón agrupado de persistencia en varias direcciones preferidas de la mirada, lo que sugiere una posición de descanso natural del ojo, o una dirección preferida de la mirada basada en características visuales dentro de la sala del laboratorio. Para determinar la persistencia de las posiciones de la mirada, los datos se dividieron y normalizaron a la posición media local cada 10 s. Usando este análisis, encontramos que la posición de la retina se mantuvo dentro de los 5˚ del ángulo visual el 80,02 ± 0,065 % del tiempo dentro de las ventanas de 10 s, lo que corresponde a la ventana de adquisición de video típica de imágenes AOSLO de alta resolución. Esto es relevante para las imágenes de alta resolución, ya que el campo subtendido para las imágenes AOSLO suele ser de 5˚, lo que sugiere que el registro de imágenes fuera de línea puede corregir el movimiento mediante enfoques de registro de tiras o cuadros sin errores de "marco fuera" que hacen que el registro de imágenes se base en características comunes o enfoques de correlación cruzada desafiantes24.

a La posición de la mirada del ratón se mide mediante el seguimiento de las compensaciones retinianas. Derecha: posición de la mirada rastreada de un ratón con la cabeza restringida durante 20 minutos superpuesta en un marco representativo de la retina. Izquierda: el seguimiento de movimiento de 20 minutos muestra los cambios de mirada en dirección horizontal (arriba) y vertical (centro). Velocidad de marcha registrada simultáneamente con un codificador rotatorio en la rueda (abajo). b Las posiciones de la mirada de los cinco ratones se normalizaron para cada ventana deslizante de 10 s durante 20 min. Los histogramas de la distribución de la posición de la mirada superpuestos en los ejes horizontal y vertical muestran una alta probabilidad de desviaciones retinales <5° (marcadas como un cuadro discontinuo) dentro de la ventana de imágenes de 10 segundos. c Correlaciones de la velocidad de la mirada del mouse y la velocidad de la marcha, el panel inferior muestra el acercamiento del conjunto de datos completo etiquetado como un cuadro gris en la parte superior para visualización.

Los datos de locomoción también se registraron simultáneamente utilizando el codificador rotatorio para investigar la posible correlación entre la locomoción y el comportamiento de la mirada. La velocidad de la marcha y el movimiento de los ojos tienen correlaciones negativas débiles, con la excepción del ratón n.º 4, que tenía una correlación positiva débil. (R = 0,0226; 0,0030; 0,1294; 0,0060; 0,0135, respectivamente). No observamos ningún cambio obvio en el comportamiento de la mirada mientras los animales estaban en reposo o en movimiento (Fig. 3c). Esto sugiere no solo grabaciones de imágenes estables independientes de la locomoción de los ratones, sino también una falta de movimiento ocular mejorado o suprimido en correspondencia con la marcha.

La escasez de parpadeos, combinada con la estabilidad del eje óptico y la apertura de la pupila en el ojo del ratón que se comportaba despierto, hizo factible realizar la detección del frente de onda y la corrección del frente de onda utilizando óptica adaptativa de bucle cerrado. Usando la pupila de entrada de 2,0 mm del ojo dilatado del ratón, encontramos que los puntos de detección del frente de onda de Hartman-Shack (HS) permanecieron brillantes y con una dispersión mínima que permitió la corrección durante más de 75 minutos (Fig. 4a-d). Esta preparación fue comparable a la preparación anestesiada óptima14,25. La posición estable de la pupila y el punto HS permitió la corrección activa de la óptica adaptativa con un recorte de la pupila insignificante. Los voltajes de corrección del frente de onda aplicados al espejo deformable estaban dentro del rango dinámico del espejo deformable, lo que indica un recorrido suficiente. Con la corrección de AO de bucle cerrado, el contraste de la imagen retiniana y la relación señal-ruido (SNR) se mantuvieron relativamente estables durante las grabaciones que duraron más de 1 h sin una degradación notable de la calidad de la imagen con el tiempo (Fig. 4e).

a, b Imágenes corregidas por AO en ratones anestesiados (a) y despiertos (b) durante 75 min. Arriba: Spotgrama de frente de onda de pupila capturado con HSWS. Medio: perfil de intensidad de punto medio de la región marcada con el rectángulo naranja). Abajo: imagen de AOSLO. La intensidad de los patrones de puntos medios se normalizó respectivamente a la intensidad máxima en los puntos de tiempo 0 en los datos de vigilia y anestesia. c, d Comparación de los perfiles de intensidad de los puntos promediados (etiquetados como líneas discontinuas en a, b) a los 0 min y 75 min. Todos los perfiles de intensidad se normalizaron respectivamente a sus valores máximos. En el ratón anestesiado, la mancha se ensanchó ligeramente en 75 min, mientras que el ratón despierto se mantuvo relativamente estable. e Gráfico de la intensidad máxima media a lo largo del tiempo. El ratón despierto mostró una intensidad máxima media relativamente estable, así como los ratones anestesiados con una preparación óptima.

Después de la corrección de AO, las imágenes AOSLO de alta resolución revelaron estructuras celulares de la retina en el ratón despierto, lo que refleja lo que era posible en estudios anteriores pero sin anestesia (Fig. 1f). Utilizando imágenes confocales NIR de 796 nm, se hicieron visibles estructuras como haces de fibras nerviosas individuales y capilares de menos de 5 µm14. Usando imágenes de contraste de fase NIR, se visualizaron estructuras translúcidas como células sanguíneas individuales16 y paredes de vasos16. Esto permitió la medición del flujo sanguíneo sin etiqueta (descrito a continuación). Para mostrar las capacidades de fluorescencia, tomamos imágenes de las células ganglionares marcadas con Thy-1 YFP y sus árboles dendríticos14 bajo una excitación de 488 nm. Las imágenes AOSLO de las tres modalidades de imágenes muestran un contraste y una resolución comparables a los capturados previamente con ratones anestesiados. Todas las modalidades de imágenes de contraste de fase, reflectancia confocal y fluorescencia NIR se realizaron utilizando niveles seguros de potencia de luz sin observar problemas de comportamiento con la luz de imágenes (200–500 µW en la córnea para NIR, 220–330 µW en la córnea para fluorescencia). Si bien no se espera que las longitudes de onda NIR sean visibles para los ratones, incluso el uso de longitudes de onda visibles brillantes no indujo una mueca o un comportamiento de parpadeo excesivo en el ratón, lo que sugiere que estos niveles de luz no inducen estrés manifiesto o fotofobia. El movimiento total del ojo en las direcciones preferidas de la mirada generalmente se mantuvo dentro de los 5° del movimiento de la retina, lo que significa que los errores de "desencuadre" en el registro de imágenes fueron poco frecuentes. Se observaron y corrigieron las correcciones restantes de alta frecuencia y baja magnitud (Video complementario 5).

Usando imágenes AOSLO, encontramos que el movimiento de la retina se caracterizaba por cambios de mirada, desviaciones lentas y un movimiento ocular de baja amplitud y alta frecuencia no informado previamente en el ratón despierto. La inspección visual de los datos de velocidad de video revela que los fotogramas individuales exhiben un rápido bamboleo/corte dentro de fotogramas individuales (~40 ms, descrito más adelante) y movimientos más grandes de la mirada que traducen el campo. Si no se corrige, dicho movimiento ocular impartirá distorsión/desenfoque de movimiento, incluso si se obtienen imágenes con óptica de difracción limitada (Video complementario 5). Se implementó un registro basado en tiras paralelo al eje de escaneo rápido (15 kHz) 26 para medir y corregir el movimiento línea por línea observado en las imágenes AOSLO del ratón despierto (Fig. 5a y Video complementario 6). Para mostrar el beneficio del enfoque de registro basado en tiras/líneas, mostramos una corrección digital de posprocesamiento del movimiento rápido del ojo con un contraste y una nitidez de características finamente detalladas muy mejorados sobre el enfoque de registro de datos sin procesar y marco de cuerpo rígido ( Figura 5b). Todas las imágenes de fluorescencia presentadas aquí tienen suficiente contraste para realizar el registro de tiras en cada modalidad de imágenes de alta resolución sin necesidad de una estrategia de registro dual24. También trazamos un perfil transversal de características objetivo específicas en cada modalidad que mostró una mejora en el contraste y la nitidez (Fig. 5c). El registro de tiras reveló detalles finos de las dendritas de las células ganglionares de la retina marcadas con YFP, el contraste vascular, así como un mayor contraste de los haces de fibras nerviosas en la superficie de la retina (Fig. 5c). Además, la corrección de movimiento basada en tiras mejoró el contraste y la nitidez del contraste de movimiento que revela con mayor precisión la perfusión del flujo sanguíneo, que es muy sensible a los artefactos de movimiento27.

a Demostración del registro de tiras utilizando una célula ganglionar de la retina marcada con YFP obtenida de un ratón despierto con la cabeza restringida. De izquierda a derecha: marco de referencia seleccionado manualmente con la menor distorsión, imagen AOSLO sin procesar distorsionada por los movimientos oculares, imagen registrada y el seguimiento del movimiento ocular en las direcciones horizontal y vertical. b Imágenes promediadas de cuatro modalidades sin registro (arriba), registro de cuadros (centro) y registro de tiras (abajo). De izquierda a derecha: imagen fluorescente de una célula ganglionar de la retina marcada con YFP; imagen de contraste de fase de un vaso sanguíneo principal de la retina (vénula); imagen de contraste de movimiento del vaso sanguíneo; Imagen de reflectancia confocal de capilares y haces de fibras nerviosas. c Los perfiles de intensidad de tres estrategias de registro cuyas ubicaciones se etiquetaron como líneas discontinuas blancas en (b). A modo de comparación, las franjas grises indican el ancho de las características de una imagen principal, mientras que las flechas indican otras características menores. En b, c, el registro de la tira muestra un contraste de imagen mejorado y SNR en las cuatro modalidades de imagen.

Tanto en el SLO comercial como en el AOSLO personalizado, observamos un movimiento ocular rápido, pero de baja amplitud, que provocó que los fotogramas individuales exhibieran oscilaciones y cortes dentro del fotograma (Video complementario 4, 5). Dichos efectos se ven a menudo en dispositivos de escaneo o aquellos con "obturador rodante" cuando el movimiento excede la velocidad de fotogramas de la cámara. El movimiento no fue un artefacto del sistema de imágenes, ya que el efecto se silenció al administrar la anestesia (Video complementario 5). El movimiento del ojo en la dirección ortogonal al vaso se puede cuantificar siguiendo la forma del perfil de cizallamiento (Fig. 6). Usando este enfoque, cuantificamos el movimiento ocular rápido que, según nuestro conocimiento, no se ha observado en el ratón despierto (Fig. 6a, by Video complementario 8) 15,16. Una transformada de Fourier de la traza del movimiento del ojo (Fig. 6c) reveló dos picos prominentes en la baja frecuencia, respectivamente, a 2 y 9 Hz. Estos picos corresponden a las frecuencias respiratorias28 y cardíacas29 características del ratón despierto. Sin embargo, también observamos una banda de potencia en las regiones de mayor frecuencia por encima de 150 Hz. La transformada de Fourier de la traza de la velocidad del movimiento del ojo (Fig. 6d) muestra una banda de velocidad cercana a los 100 Hz con un ancho de banda (30-150 Hz). En especies foveadas, esta banda de frecuencia es característica del temblor ocular30; sin embargo, es notable aquí porque los ratones carecen de fóvea y tienen una agudeza visual de 0,5 c/grado31. La amplitud del movimiento ocular de alta frecuencia fue de ~6 µm, que es mucho menor que la resolución de los dispositivos oftálmicos convencionales, lo que puede explicar por qué se ha pasado por alto anteriormente.

a Medición de movimientos oculares de baja amplitud pero de alta frecuencia utilizando imágenes de barrido lineal a través de un vaso sanguíneo (vena) retiniano importante. Izquierda: imagen cartesiana de la vena. La flecha negra indica la ubicación de las imágenes escaneadas en línea. Derecha: imagen escaneada de línea de la vena con trazo de movimiento superpuesto como línea blanca. b Arriba: rastro de temblor ocular de alta frecuencia resaltado con un filtro de paso alto (>30 Hz). Abajo: traza de la velocidad de movimiento del ojo. c Transformada de Fourier de la traza del movimiento del ojo (sin filtrar). Se observaron potencias hasta 200 Hz. Se observaron dos picos prominentes de baja frecuencia, respectivamente, a 2 Hz (120 lpm) y 9 Hz (540 lpm), que pueden deberse a los latidos respiratorios y cardíacos. d Transformada de Fourier de la velocidad de movimiento del ojo. Se observó una potencia elevada a 30-200 Hz, lo que indica el ancho de banda del temblor ocular.

Bajo anestesia, es raro que se pueda obtener una imagen del ojo del ratón durante más de 2 h a la vez debido a la tolerancia a la anestesia, el desarrollo de opacificación anterior o la probabilidad de recuperación después de una anestesia sostenida32,33,34. Por lo tanto, la preparación despierto permite sesiones de imágenes semicontinuas que duran muchas horas. Para demostrar esta capacidad y calidad de formación de imágenes durante largos intervalos, se tomaron imágenes del mismo ratón despierto y con comportamiento durante 10 horas consecutivas con un intervalo de 1 h (Fig. 7a). El tiempo de obtención de imágenes de 10 h abarcó tanto los períodos normales de vigilia como de sueño del ciclo circadiano de luz y oscuridad (las primeras 4 h corresponden a las horas de luz en el vivero y las 6 h restantes corresponden a las horas de oscuridad). A pesar de los cambios de mirada ocasionales que cambian naturalmente el campo de imágenes, podríamos volver al mismo campo de imágenes con una precisión de <3˚ ajustando manualmente la orientación del mouse para brindar consistencia en cada sesión de imágenes (Fig. 7b y Video complementario 7). Para mostrar una de esas aplicaciones, estudiamos el movimiento ocular de alta frecuencia en función de la hora del día durante 10 h. La amplitud del movimiento ocular rápido fue constante durante 10 h con una media de 5,95 µm o 10,50 minutos de arco (Fig. 7c). Los espectros de potencia del punto de todos los tiempos también sugirieron un ancho de banda de frecuencia constante de la velocidad de movimiento (Fig. 7d, e y Video complementario 9).

una proyección de imagen AOSLO longitudinal de 10 h en el mismo ratón de comportamiento despierto con la cabeza restringida. La imagen duró 11 h, con una sesión de imagen de 10 min cada 1-1,5 h. Se mostraron imágenes cartesianas AOSLO representativas de la misma vena en cada sesión. b El montaje de imágenes cartesianas con bordes codificados por colores con marcas de tiempo muestra la capacidad de navegar y localizar la misma vena en diferentes sesiones de imágenes durante 10 h. c Amplitud media del temblor ocular medida a partir de los datos escaneados en línea de la misma vénula durante 10 h. La barra de error indica la desviación estándar de la amplitud del movimiento ocular en todos los puntos de tiempo (N = 15 000 líneas). d FT de la traza de la velocidad del movimiento del ojo que muestra espectros de potencia idénticos durante 10 h con un ancho de banda constante de 30 a 200 Hz. e Otra vista en perspectiva de los mismos datos que (d). La línea gris superpuesta muestra el promedio de todos los espectros de potencia.

El movimiento ocular de alta frecuencia se midió en un ratón primero en estado de vigilia, luego después de la inyección de K/X durante ~2 h. Observamos que el movimiento ocular de alta frecuencia se eliminó rápidamente después de la inducción de la anestesia (Fig. 8a, by Video complementario 10). La cuantificación de este efecto se muestra en la Fig. 8; sin embargo, la atenuación visible del movimiento de alta frecuencia también es evidente en el video complementario 5, donde se muestran las mismas ubicaciones en la retina minutos después de la inyección de K/X. El movimiento ocular fue <10 µm durante 80 min, lo que sugiere que no solo se suprimieron los cambios de posición de la mirada, sino que también se suprimieron los movimientos similares a temblores de alta frecuencia. Ochenta minutos después de la inyección de K/X, se observaron leves espasmos y sacudidas en la cara. Tanto el movimiento ocular rápido como el dependiente de la mirada regresaron gradualmente a condiciones similares a las de la línea de base (Fig. 8c).

a La medición del movimiento ocular muestra la ausencia de movimientos oculares bajo anestesia profunda, luego reaparece bajo anestesia superficial pero con menor velocidad en comparación con el estado de vigilia. El código de color indica el lapso de tiempo de la imagen donde el verde es el estado de vigilia, el magenta es el estado de anestesia profunda y el cian es el estado de anestesia superficial. b Perfiles de velocidad de movimiento del ojo y c Sus espectros de potencia en cada punto de tiempo revelan relativamente no solo una velocidad más baja sino también un ancho de banda de frecuencia más bajo bajo anestesia superficial en comparación con el estado de vigilia.

El flujo sanguíneo se midió usando la técnica previamente reportada en ratones15 con reposacabezas. Brevemente, cuando se realizan imágenes de barrido lineal a través de un vaso sanguíneo, el glóbulo que fluye genera una trayectoria en ángulo en la imagen del espacio-tiempo, lo que indica un cambio de posición a lo largo del tiempo escalado por el ángulo de incidencia del haz a través del vaso15. La velocidad de las células sanguíneas se puede cuantificar midiendo la pendiente de los perfiles de células sanguíneas (Fig. 9a y Fig. S6). Se encontró que el flujo era pulsátil (Fig. 9b) pero a diferentes frecuencias y velocidades correspondientes a la frecuencia cardíaca variable con anestesia (481 y 758 Hz en dos ratones despiertos), correspondientes a frecuencias cardíacas mucho más altas35 en comparación con las medidas en ratones anestesiados ( 271,2 ± 1,2 Hz, n = 5 vasos sanguíneos de tres ratones). El flujo sanguíneo en una sola vénula se redujo en un 43 % con respecto a la medida inicial (1,56 a 0,89 µl/min) 20 min después de la anestesia (Fig. 9c). Las medidas independientes mostraron un estrechamiento abrupto del diámetro del vaso justo después de la inyección de K/X, mientras que el cambio en la velocidad de la sangre fue menor al principio pero disminuyó sustancialmente con el tiempo después de 20 minutos de inyección de K/X. Estos dos parámetros no mostraron cambios equivalentes, lo que subraya la importancia de las mediciones directas para revelar una imagen completa del flujo sanguíneo y su regulación36. Mientras que el movimiento de los ojos (discutido anteriormente) regresa gradualmente 80 min después de la inducción de K/X, el flujo sanguíneo se mantuvo bajo (0,66 μl/min), que estaba un 58 % por debajo del valor inicial. Estos hallazgos sugieren que el retorno del movimiento ocular precedió al retorno del flujo sanguíneo retiniano, lo que indica que el retorno de la función fisiológica se produce a diferentes velocidades en el mismo ratón después de la anestesia K/X. Las mediciones de flujo de los ratones despiertos (n = 5 vasos de tres ratones) también se compararon con los datos informados previamente de nuestro grupo en ratones anestesiados (n = 123 vasos de 20 ratones, Fig. 9d)15,19. A pesar de los vasos individuales donde la velocidad se redujo bajo anestesia, encontramos que, en general, la relación entre el flujo y el diámetro del vaso fue generalmente similar. Las curvas de flujo de diámetro del modelo ajustado (detalladas en Métodos) muestran diferencias generales menores en el flujo sanguíneo total.

a Imagen escaneada en línea del mismo vaso sanguíneo grande en la retina de un ratón en los estados de anestesia (arriba) y despierto (abajo). Las células sanguíneas individuales que fluyen detectadas se etiquetaron con líneas con un código de color que representa sus velocidades. b Velocidades de flujo sanguíneo medidas de los datos que se muestran en (a). Se observó pulsátil tanto en los datos de vigilia como en los de anestesia. Se observaron una mayor frecuencia cardíaca y velocidad de flujo en el ratón despierto. c El flujo sanguíneo medido en un vaso a lo largo del tiempo muestra la supresión del flujo sanguíneo bajo anestesia. d El flujo sanguíneo unicelular medido en ratones despiertos (verde, n = 5 vasos, 3 ratones) se compara con una población de ratones anestesiados (púrpura, n = 123 vasos, 20 ratones). Las curvas del modelo de flujo-diámetro se ajustan a los datos.

Medimos la morfología de la retina que varió desde el estado despierto hasta el estado anestesiado usando OCT en cuatro ratones. Se tomaron imágenes de todos los ratones en el cuadrante temporal superior del ojo derecho con un FOV de 30°. Observamos que los ratones sometidos a anestesia mostraron un engrosamiento retinal sustancial durante dos horas, mientras que los ratones en estado de vigilia no lo hicieron (Fig. 10a). El grosor total de la retina (TRT) se cuantificó mediante un software personalizado a partir de los cubos 3D OCT (Fig. 10b), las mediciones de cada punto de datos se muestran en la Fig. S8. A los 80-110 min después de la inyección, el grosor de la retina en ratones anestesiados alcanzó un aumento máximo de 8,0 ± 4,1 μm (n = 4 ratones) con un engrosamiento promedio de 3,9 ± 2,0 % (p = 0,034, Fig. 10c), mientras que no hubo cambios significativos. se observó engrosamiento en retinas de ratones control despiertos (p = 0,179, n = 4 ratones). El efecto espesante continuó progresando en el último punto de tiempo de la medición. El mapa frontal del cambio de TRT también sugirió que dicho efecto de engrosamiento era uniforme en las regiones y excentricidades de la retina (Fig. 10d, e).

a Imágenes longitudinales de la retina del ratón OCT en los estados despierto y anestesiado. Se observó un engrosamiento de la retina asociado con el lapso de tiempo posterior a la inyección de anestesia K/X. b Espesor total de la retina (TRT) medido a partir de los cubos OCT. Muestra un efecto espesante sustancial después de 60 minutos después de la inyección de anestesia KX. c Las mediciones de ratones N = 4 (media ± DE) muestran un engrosamiento significativo relacionado con la inyección de KX (prueba t de Student bilateral). d La evaluación de los cambios de TRT frente a tres rangos de excentricidad en la retina no muestra una diferencia significativa (gráfico de línea negra, media ± SD, N = 4 ratones). Los mapas frontales de cambio de TRT tampoco muestran diferencias locales notables relacionadas con regiones o estructuras en la retina.

La preparación del ratón con la cabeza restringida facilita un eje óptico estable a través del cual se pueden obtener imágenes de las mediciones estructurales y funcionales a escala celular del ojo del ratón despierto con modalidades de imágenes oftálmicas estándar y de alta resolución. La creación de este eje de imagen ocular estable aún permite la deambulación libre del ratón, lo que reduce el estrés del confinamiento y además permite una puerta de entrada para los estudios de comportamiento y la interacción visual del ratón con entornos con o sin anestesia. Esto permite un nuevo dominio de investigación de la retina en el ratón que puede examinar y/o corregir el impacto de la anestesia en las imágenes de la retina, ya que muchos estudios han examinado dicho impacto en la corteza5. Para demostrar un aspecto del impacto de la anestesia, hemos, por primera vez, caracterizado y comparado las mediciones del flujo sanguíneo en los estados de vigilia y anestesia en los mismos ratones. Al medir el flujo sanguíneo retiniano (RBF), mostramos que la anestesia KX suprime el flujo sanguíneo. Esto confirma la evidencia de estudios anteriores9,37, pero ahora proporciona una resolución a nivel de micras, que es fundamental para medir con precisión el flujo sanguíneo que se encuentra dentro de vasos mucho más pequeños que 3-45 micras en el ratón15. Este trabajo es esencial para comprender los fundamentos del acoplamiento neurovascular y la regulación del flujo microvascular en modelos de enfermedades que se estudian mejor sin el impacto de la anestesia, que puede confundir o atenuar la dinámica y el estado de referencia. También encontramos que la anestesia KX induce un engrosamiento retiniano apreciable medido por OCT. Hasta donde sabemos, no se ha informado tal engrosamiento progresivo y los mecanismos no están claros. Si bien es especulativo, postulamos que el grosor retiniano observado y el cambio de RBF pueden verse afectados por cambios en la presión intraocular38 que pueden ser modulados por la anestesia KX39. También se ha encontrado que la anestesia KX induce depresión de la frecuencia cardíaca y respiratoria y disminuye la presión arteriolar media, lo que podría inducir un cambio de RBF40. Si bien se necesita más trabajo para informar la naturaleza de tales cambios, este hallazgo subraya la importancia de realizar tales mediciones en el estado de vigilia, ya que la anestesia puede sesgar la interpretación de las mediciones de la enfermedad en ratones in vivo, especialmente porque puede confundir las interpretaciones convencionales de la retina. pérdida/supervivencia celular.

Vale la pena reflexionar que, si bien los estudios de imágenes de la retina in vivo se han esforzado por eliminar el movimiento ocular con el objetivo de obtener una plataforma de imágenes estable, tiene como consecuencia eliminar la entrada natural al ojo. Aquí, reconocemos que dejar intacto el movimiento natural del ojo brinda la oportunidad de comprender mejor cómo el movimiento del ojo y el sistema visual funcionan juntos para proporcionar la visión del organismo41. Para demostrar uno de esos ejemplos, mostramos imágenes activas durante el comportamiento de mirada libre del ratón despierto. Al igual que los humanos, existe una preferencia temporal-nasal cuando el ratón escanea el horizonte visual21. También encontramos que los ratones tienen posiciones de mirada preferidas (Fig. 3) a pesar de carecer de la capacidad de fijación que normalmente se atribuye a los mamíferos foveados21. En una escala más fina habilitada por AOSLO de alta resolución espaciotemporal, revelamos un movimiento ocular de alta frecuencia y baja amplitud con una frecuencia temporal similar al microtemblor ocular humano (OMT). Provocativamente, la amplitud del movimiento ocular rápido en ambas especies corresponde aproximadamente a la mitad del tamaño de la agudeza visual máxima reportada30. En estudios posteriores, será interesante ver si este movimiento ocular podría ser una característica conservada de la visión de los mamíferos que aumenta con el tamaño del campo receptivo o la agudeza visual. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de este movimiento de alta frecuencia y baja amplitud en el ratón (Fig. 6). La incorporación de esta entrada visual retiniana dinámica podría tener consecuencias notables para la caracterización espaciotemporal de los campos receptivos visuales en el ratón que se extienden desde la retina hasta la corteza 42,43,44. Mostramos que dicho movimiento ocular se mantiene durante 10 h a lo largo del ciclo circadiano día/noche (Fig. 7). Es importante destacar que este movimiento ocular de alta frecuencia se elimina con la aplicación de anestesia, lo que es beneficioso para obtener imágenes de alta resolución (eliminando el desenfoque de movimiento); sin embargo, también elimina esta información como entrada natural a la tasa de video o estímulos visuales estáticos. La investigación adicional puede revelar un requisito común de la visión de los mamíferos para incorporar un movimiento ocular determinado a esta escala microscópica para mejorar el contraste espaciotemporal para el sistema visual30,41. En línea con este interés, el impacto de la marcha ha indicado, en algunos estudios, un aumento aparente en la agudeza visual y la ganancia de respuesta de ciertas neuronas visuales asociadas con la locomoción en el ratón45 que ahora puede estudiarse a nivel de la retina. También consideramos que las mediciones de movimientos oculares de baja amplitud y alta frecuencia podrían proporcionar un biomarcador nuevo y útil para enfermedades neurodegenerativas en numerosos modelos de ratones que buscan cuantificar la integridad de los circuitos neuronales responsables del control del movimiento ocular46. Finalmente, vale la pena señalar que más allá del estudio de dicho movimiento ocular en la búsqueda de la comprensión de la función y el control neuronal, la contabilidad y la corrección del movimiento ocular son esenciales para lograr imágenes de alta resolución de la retina. Si no se corrige, provocará desenfoque de movimiento en modalidades de imagen de alta resolución con tiempos de exposición de más de ~5 ms (frecuencia de cuadro de 200 Hz). Y aunque la fotografía con flash podría mitigar ese desenfoque, hasta la fecha hay pocos oftalmoscopios de adquisición de video que alcancen estas velocidades de imagen, especialmente para el ratón. Esto significaría que incluso con una óptica perfecta, la imagen retiniana despierta sería borrosa en una escala de 10 a 20 micrómetros. Por lo tanto, las imágenes de alta resolución deben lograr tanto la corrección de la aberración como las imágenes/registro de alta velocidad > 200 Hz para lograr un potencial limitado por difracción en el ratón despierto.

Renunciar a la anestesia también tiene una gran ventaja en el estudio de la fisiología in vivo durante intervalos de tiempo más largos. Los estudios realizados hasta la fecha en ratones se han centrado en imágenes de retina anestesiadas que se limitan en gran medida a 30-120 min. Esto se debe a la intolerancia a la anestesia (pobre supervivencia de los animales) oa la formación transitoria de cataratas cuando se obtienen imágenes durante períodos más prolongados. Aquí mostramos que es posible realizar un protocolo de imagen semicontinuo que permite obtener imágenes del mismo animal durante más de 10 h o más. Las grabaciones totalmente continuas son posibles si las preguntas científicas correctas lo justifican; sin embargo, se recomiendan pausas para que los animales se recuperen en su jaula para comer, descansar y dormir. Este paradigma abre una enorme ventana temporal para probar con precisión los desafíos fisiológicos a escala de horas, si no de días. Por ejemplo, los cambios circadianos, la respuesta a la terapia farmacológica, el movimiento de las células inmunitarias36, la modulación glucémica sistémica y los regímenes de ejercicio47 ahora pueden estudiarse durante el transcurso de segundos a horas en una sola sesión, y de forma semicontinua durante días sin toxicidad anestésica acumulada o complicaciones de las opacidades anteriores que clásicamente han limitado dicho estudio requiriendo anestesia.

El ratón de laboratorio se encuentra entre los modelos más populares utilizados para recapitular aspectos de la enfermedad humana, y aquí acercamos el modelo un paso más para capturar la fisiología normal del ojo de los mamíferos al obviar la necesidad de anestesia. Para que este enfoque esté disponible a nivel mundial, se proporciona una solución imprimible en 3D de bajo costo que se puede replicar en cualquier laboratorio que tenga acceso a una impresora 3D y acceso a piezas de libre mercado. Este diseño está destinado a proporcionar una prueba de concepto y democratizar las mediciones oculares estables en el ratón sin anestesia. Hay innumerables aplicaciones que pueden aprovechar este trabajo que tienen el potencial de avanzar en nuestra comprensión de los fundamentos de la visión, el comportamiento, la estructura neuronal, la integridad funcional y la fisiología básica de la visión del ratón. Esperamos que algunas de las primeras aplicaciones prueben el impacto de la anestesia en una serie de funciones fisiológicas básicas. Otros pueden usar la resolución y las capacidades de seguimiento de la retina para mejorar las grabaciones microscópicas y rápidas de la posición del ojo en entornos visuales simulados o de visualización libre. Sostenemos que las comparaciones de la fisiología visual entre el ratón y el hombre ahora son aún más cercanas al obviar la necesidad de anestesia que rara vez se usa en imágenes oftálmicas clínicas. Finalmente, el valor de la evaluación a largo plazo que dura de horas a días permitirá un nuevo régimen de estudio de la fisiología y la estructura a través de una nueva ventana de tiempo que es críticamente valiosa para la respuesta a la terapia, los ciclos circadianos y cambios más graduales que de lo contrario, se perdería debido a los desafíos logísticos de las ventanas de imágenes limitadas confinadas por la anestesia. Combinados, esperamos que esto represente el comienzo de nuevos estudios emocionantes en estudios neuronales y de comportamiento en el ratón, uno de los socios más poderosos en la investigación biomédica.

La cabeza del ratón estaba restringida por una abrazadera que sujetaba un brazo colocado lateralmente de su placa de cabeza en forma de Y implantada quirúrgicamente. La placa de cabeza se colocó verticalmente sobre una rueda para correr (90 mm de diámetro) de modo que el ratón pueda deambular libremente con una postura y marcha naturales durante la obtención de imágenes. El posicionamiento lateral de la pinza también permite obtener imágenes factibles del ojo contralateral. La abrazadera constaba de dos piezas entrelazadas impresas en 3D para crear un ajuste perfecto alrededor de la placa de la cabeza, lo que garantizaba un reposacabezas estable a pesar de que solo se sujetaba por un lado. Todos los componentes de la plataforma de la rueda, excepto el cojinete y el eje, se imprimieron en 3D con ácidos polilácticos (Ultimaker, Ultimaker BV, Utrecht, Países Bajos). Se adjuntó un codificador rotatorio (ENS1J-B28 L00256L, Bourns, Inc, Riverside, CA, EE. UU.) al eje de la rueda, lo que les permitió girar sincronizados. La salida del codificador fue adquirida por una placa de adquisición de datos (USB-6001, National Instruments, Austin, TX, EE. UU.). La distancia y la velocidad de la marcha se extrajeron de las señales de salida del codificador con MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Massachusetts, EE. UU.). Los datos de locomoción se sincronizaron fuera de línea en función de las marcas de tiempo de los datos de imágenes adquiridos simultáneamente. Los archivos de impresión 3D y las instrucciones de ensamblaje detalladas están disponibles públicamente en "https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.git".

Todos los estudios con animales se realizaron según las pautas del Instituto Nacional de Salud y fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Se adquirieron ratones C57BL/6J de The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Se utilizaron doce ratones de 6 a 10 meses de edad para los experimentos. Todos los animales se alojaron en las instalaciones de animales de laboratorio The Vivarium en el Centro Médico de la Universidad de Rochester en un ciclo de luz-oscuridad de 12 y 12 h con comida y agua ad libitum.

El protocolo de línea de tiempo de la implantación de la placa de cabeza y el entrenamiento de animales se muestra en la Fig. S1. Se administró una inyección subcutánea de buprenorfina (0,5-1 mg/kg) 24 h antes de la cirugía. El día de la cirugía, los ratones se pesaron, anestesiaron, transfirieron a un marco estereotáctico para animales pequeños (modelo de la serie 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.) y se aseguraron con las barras para las orejas y la barra incisiva para un cráneo plano. Primero se afeitó la superficie dorsal de la cabeza y luego se limpió la piel con una almohadilla preparada con alcohol isopropílico al 70 % (Número de catálogo: MDS090735, Medline, Northfield, IL, EE. UU.). Se realizó una incisión en la línea media desde la base del cráneo hasta el hueso frontal entre los ojos, de aproximadamente 2-3 cm de longitud. Luego se hicieron incisiones laterales donde el músculo temporal se inserta en el cráneo. La fascia suprayacente se eliminó suavemente mediante disección roma e irrigación frecuente para exponer la superficie del cráneo. A continuación, se sujetó firmemente sobre el cráneo un cabezal impreso en 3D en forma de Y mediante la aplicación de una mezcla de cemento dental (Jet XR Shadow Powder, Lang Dental, Wheeling, IL, EE. UU.) y pegamento de cianoacrilato (proporción 2:1) (Krazy Glue Maximum Bond , Krazy Glue, Estados Unidos). La placa frontal debe estar centrada sobre la intersección de la sutura coronal y el bregma, con un brazo medial alineado con la línea media hacia el hueso nasal. Los ratones se colocaron en un alojamiento individual con casas de cartón para recuperarse durante 3 días después de la cirugía. En general, la salud de los ratones se controló todos los días mediante la observación visual del aspecto del pelaje y el nivel de actividad. Después de la recuperación, se realizaron al menos cinco sesiones de entrenamiento de 30 a 60 minutos para aclimatar a los ratones a la plataforma de imágenes restringida a la cabeza. Se controló el peso del ratón para cada sesión de entrenamiento. En las dos primeras sesiones, los ratones se anestesiaron superficialmente con una mezcla de ketamina y xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina) y luego se recuperaron con la cabeza restringida en la plataforma para permitir la familiarización. Después de la recuperación, se permitió que el ratón deambulara durante 30-45 minutos. Estas dos sesiones de entrenamiento se realizaron con 24 h de diferencia para evitar la aplicación consecutiva de anestesia. Se realizaron tres o más sesiones de entrenamiento posteriores de 45 minutos sin anestesia, lo que permitió a los ratones aclimatarse a la condición de sujeción de la cabeza en el estado completamente despierto. Los ratones que muestran un modo de andar y una postura estables, así como características de comportamiento relajado, como el aseo personal, se consideran aclimatados y listos para la toma de imágenes.

Cuando se tomaron imágenes con el ratón que se comportaba despierto, no se aplicaron procedimientos adicionales en el ojo, excepto la dilatación de la pupila. La dilatación de la pupila se aplicó en ratones despiertos o anestesiados, lo que se logró colocando gotas para los ojos de tropicamida al 1% (Sandoz, Basilea, Suiza) y fenilefrina al 2,5% (Akorn, Lake Forest, Illinois, EE. UU.). Las imágenes se realizaron en un entorno oscuro con una fase de adaptación a la oscuridad de 10 a 15 minutos antes del inicio de cada sesión de imágenes. Debido a que el ajuste del eje de rotación del rollo con el mouse estaba limitado en nuestra plataforma, el FOV de las imágenes AOSLO se encontraba principalmente en el cuadrante superior de la retina. Cuando se tomaron imágenes con ratones anestesiados, se aplicó una inyección intraperitoneal con una mezcla de clorhidrato de ketamina (dosis de 100 mg/kg) y xilazina (dosis de 10 mg/kg). Se utilizó una almohadilla térmica externa y un termómetro de sonda rectal (Physiosuite, Kent) para controlar y mantener una temperatura corporal de 37,0 °C para los ratones anestesiados. Para prevenir la opacificación ocular inducida por la deshidratación bajo anestesia, se colocó una lente de contacto (Advanced Vision Technologies, Lakewood, Colorado, EE. UU.) sobre el ojo del que se estaba tomando la imagen y una lágrima artificial (GenTeal, Alcon Laboratories, Inc, Fort Worth, Texas, EE. UU. ) se aplicó de forma rutinaria cada 20 minutos durante la obtención de imágenes.

Las imágenes SLO y OCT se realizaron con una plataforma comercial multimodal de imágenes retinales (HRA Spectralis, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania). Las imágenes OCT y SLO se capturaron con el objetivo FOV de 30° a menos que se especifique lo contrario. La resolución de píxeles de SLO fue de 1536 × 1536, mientras que los cubos OCT tenían 1536 × 596 × 97 vóxeles. El FOV frontal del cubo OCT fue de 20° × 20° y con registro utilizando la función de seguimiento retinal automatizado (ART) incorporada. Cada segmento de OCT también se promedió en 40 fotogramas para mejorar la SNR.

El AOSLO multicanal fue descrito en la literatura previa14. Permite obtener imágenes de la retina con modalidades que incluyen imágenes confocales de reflectancia, de contraste de fase y fluorescentes. Las imágenes de reflectancia confocal y contraste de fase se realizaron con un diodo láser superluminiscente de 796 nm con un ancho de banda de 17 nm (200–500 µW en la córnea, S790-GI-15, Superlum, Irlanda), mientras que un diodo láser de 488 nm (220–330 µW en la córnea, iChrome MLE, Toptica Photonics, Farmington, NY, EE. UU.) se utilizó como fuente de excitación para la formación de imágenes fluorescentes. Se utilizó un agujero de alfiler 2.1 ADD en el plano de la imagen del canal NIR para obtener imágenes de reflectancia confocal y contraste de fase. Para proporcionar imágenes de contraste de fase, el agujero de alfiler se desplazó lateralmente por ~22 ADD (Guevara, 2020). Se aplicó un sensor de frente de onda Hartmann-Shack (HSWS) para medir el frente de onda del ojo del ratón en tiempo real. Combinado con el espejo deformable (DM97-1, ALPAO, Montbonnot-Saint-Martin, Francia), la aberración inherente en el ojo del ratón se corrigió en bucle cerrado.

Al enfocarse en los párpados y el canto, se tomaron imágenes de la pupila de salida del ojo del ratón utilizando NIR SLO a una velocidad de 8,8 fps con 768 × 768 píxeles. La formación de imágenes se realizó en cinco ratones con placa de cabeza sanos en estado de vigilia. Cada sesión de imágenes abarcó ~ 20 min, y se grabaron 17 videos durante la duración máxima que permitió el sistema (59,88 s), con espacios que variaron de 5 a 30 s según el tiempo de almacenamiento en búfer de datos entre dos adquisiciones. Se utilizó un algoritmo de seguimiento de pupila personalizado escrito en Matlab para rastrear automáticamente la región de la pupila del video SLO. Se utilizó una estrategia de segmentación basada en la textura (Fig. S2). Primero, se aplicó un filtro de desviación estándar (STD) a la imagen para resaltar la región de la pupila, mientras que la pupila tiene una variación espacial menor en comparación con los tejidos circundantes, como el párpado y el pelaje. Luego, el mapa espacial de STD se binarizó con umbralización (STD <0.25) y la región de la pupila se segmentó con un algoritmo de cuenca hidrográfica. El contorno del área de la pupila finalmente se dotó de una función elíptica. Las puertas lógicas se configuraron para eliminar los falsos positivos con cambios anormalmente grandes y rápidos en el tamaño y la posición de la pupila detectada. El rendimiento de coincidencia de la pupila se cuantificó como el área de superposición entre la pupila de salida segmentada del ojo del ratón y una pupila de entrada circular virtual estática ubicada en la posición media de todos los puntos de datos. Al analizar la correlación con la locomoción del ratón, los datos coincidentes de la pupila se promediaron en intervalos de tiempo de 1 s para alinear los datos de locomoción registrados simultáneamente.

Los protocolos del experimento para la medición del parpadeo y el cambio de mirada fueron idénticos a la medición de la pupila, con la única diferencia de que el SLO se centró en la capa de fibras nerviosas de la retina. Aquí, el evento de parpadeo se detectó en función de la intensidad de imagen media de los fotogramas. Se consideró que un cuadro experimentaba un evento de parpadeo cuando la intensidad de su imagen estaba por debajo del 60 % de la intensidad de imagen promedio de todo el video (Fig. S3). Implementamos un algoritmo de seguimiento retinal semiautomático escrito en Matlab para cuantificar las compensaciones globales para la imagen retinal SLO. Primero se seleccionaron manualmente tres plantillas de referencia diferentes con características bien definidas, como el disco óptico y las uniones de los vasos sanguíneos, a partir de una imagen de referencia (Fig. S4a). El tamaño y la ubicación de las plantillas fueron determinados por usuarios experimentados a través de una interfaz de usuario guiada. Las tres plantillas se usaron como referencia para realizar una correlación cruzada 2D con cada cuadro de imagen retiniana (Fig. S4b). El desplazamiento retiniano se determinó mediante uno de los tres desplazamientos relativos extraídos de la correlación cruzada 2D, que tiene el coeficiente de correlación normalizado (NCC) más grande (Fig. S4c). Se implementaron puertas Logit para eliminar los puntos de fecha cuando se experimentan parpadeos.

Se utilizó un algoritmo de registro personalizado basado en tiras del que se informó anteriormente para corregir la distorsión de movimiento de las imágenes AOSLO26. Brevemente, la imagen se separó en tiras a lo largo del eje de escaneo lento, y cada tira se registró en la imagen de referencia individualmente con correlación cruzada 2D para corregir el efecto de corte inducido por los movimientos oculares rápidos. Aquí, el ancho de la tira seleccionada fue de 32 líneas (equivalente a una frecuencia de muestreo de 468 Hz), que está ligeramente por encima de la frecuencia de Nyquist del ancho de banda superior de los movimientos oculares de alta frecuencia (~200 Hz). Las tiras registradas con un NCC inferior a 0,5 se consideraron "registro fallido" y se eliminaron de la imagen registrada. Para registrar la imagen fluorescente, todas las imágenes se convolucionaron con un kernel gaussiano 2D con \(\sigma =5\) píxeles antes del registro para mejorar el rendimiento de correlación cruzada 2D para recuentos de fotones débiles.

El movimiento ocular de alta frecuencia y baja amplitud se midió con AOSLO al escanear un haz de imágenes 1D a través de un vaso sanguíneo retiniano principal a 15 kHz. Cuando existe el movimiento del ojo, el perfil espaciotemporal de la imagen del vaso sanguíneo se cortará (Fig. S5a derecha). La amplitud del componente de movimiento del ojo ortogonal al vaso sanguíneo \(\left|{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|\) se puede extraer como: \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|=\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|{{\sin }}(\theta )\), donde \(\theta\) es el ángulo entre el vaso sanguíneo y el eje de exploración, y \(\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|\) es el corte del perfil del vaso sanguíneo en el espacio-tiempo (Fig. S5a izquierda ). Se utilizó un algoritmo totalmente automatizado para extraer la traza de corte similar al algoritmo de registro de bandas para la corrección de movimiento, pero solo realiza una correlación cruzada 1D a lo largo de la dirección espacial. Primero se seleccionaron al azar veinte tiras de referencia con un ancho de 32 líneas de escaneo de la imagen espaciotemporal (Fig. S5b). Se realizó una correlación cruzada 1D a lo largo del eje espacial con cada tira de referencia para producir 20 trazas candidatas, que luego se alinearon mediante la normalización a los valores medios. Los puntos de datos compensados ​​en las trazas candidatas tienen cambios de más de 10 píxeles en comparación con el punto de tiempo anterior, se trataron como falsos positivos y se excluyeron del análisis futuro. Finalmente, las 20 trazas candidatas se fusionaron como la traza de movimiento de salida final punto por punto mediante el cálculo del valor medio (Fig. S5c). Los rastros de movimiento extraídos se validaron mediante un examen visual realizado por un usuario experimentado investigando las imágenes de espacio-tiempo registradas (Fig. S5d), las mediciones con imágenes mal registradas se consideraron "fallidas" y se eliminaron del análisis.

El flujo sanguíneo de una sola célula se midió de forma no invasiva en ratones despiertos utilizando un enfoque que se ha descrito ampliamente en nuestra publicación anterior15. Brevemente, los vasos sanguíneos se escanearon oblicuamente en 1D (15 kHz) congelando el escáner lento (galvo) y los escaneos consecutivos se concatenaron a lo largo del tiempo para formar una imagen de espacio-tiempo (Fig. S6a). Los glóbulos aparecen como rayas diagonales, lo que indica su posición en el escaneo. La pendiente de la racha combinada con el ángulo entre la dirección del flujo y la posición del escaneo 1D (extraído de la imagen ráster 2D adquirida posteriormente) se utilizó en un algoritmo automatizado que emplea la transformada Radon para extraer la velocidad de las células sanguíneas. En nuestras imágenes de espacio-tiempo, las rayas que se acercan a una orientación vertical representan celdas de mayor velocidad. El algoritmo de radón opera dividiendo imágenes de espacio-tiempo en ROI superpuestos. Cada ROI se rota iterativamente 180° y se extrae una proyección de intensidad 1D para cada iteración. La desviación estándar se calculó para cada proyección 1D y el valor más alto indicó el ángulo dominante y, por lo tanto, produjo una velocidad para el ROI. El ancho de banda de medición de esta técnica fue de 0,03 a 1275 mm/s, que fue más que suficiente para medir las velocidades biológicamente posibles de las células sanguíneas en la retina del ratón despierto. El flujo pulsátil se midió con alta resolución espaciotemporal y se superpuso como un mapa de colores de velocidad en la imagen del espacio-tiempo (Fig. S6b). Para determinar el diámetro de la luz del vaso, se generaron imágenes de contraste de movimiento del vaso sanguíneo a partir de imágenes cartesianas 2D. La obtención de imágenes de la luz dispersada hacia delante y de forma múltiple a través de la columna de glóbulos rojos dentro de microvasos de menos de 50 µm de tamaño ayudó a obtener una medición precisa del diámetro del lumen. Combinadas, las mediciones de velocidad y diámetro dieron el caudal medio (en µL/min) a través de cada recipiente. Estas mediciones se realizaron simultáneamente con las de los movimientos oculares descritas en la sección anterior. Las curvas del modelo de flujo-diámetro se ajustaron a los datos medidos en comparación con las dos poblaciones. Brevemente, el modelo utilizado fue de la forma y = axb. donde y es el caudal (µL/min) yx es el diámetro (µm).

La medición del espesor retiniano se realizó con HRA OCT. El modo "Seguimiento" se usó para realizar imágenes longitudinales en la misma ubicación en la retina con el primer punto de tiempo como referencia. El grosor total de la retina (TRT) se definió como la distancia entre el límite de la membrana limitante interna del vítreo (ILM vítreo) y el límite del epitelio pigmentario de la retina del segmento externo (OS-RPE) (Fig. S7a, b). En el análisis se ocultó una región circular centrada en el disco óptico con un grado visual de 8°, que es difícil de segmentar (Fig. S7c). Las capas fueron detectadas por un algoritmo de segmentación de programación dinámica de teoría de grafos personalizado basado en la estrategia informada previamente por la ref. 48.

Todos los datos en el estudio actual provinieron de 12 ratones en el fondo C57BL/6 J del stock de Jackson Labs (Bar Harbor, ME) (CX3Cr1, thy-1 YFP, stock B6). Se tomaron imágenes de los ratones como directamente de los laboratorios de Jackson o en unas pocas generaciones de progenie de colonias de los ratones fundadores originales. Todas las mediciones en el estudio se realizaron varias veces en el mismo ratón (p. ej., Figs. 2–4, 6–9) o en varios ratones para comparar. Al comparar dos tiempos o grupos diferentes, las diferencias se evaluaron en función de una prueba t pareada simple para comparar condiciones. Las pruebas estadísticas se realizaron en Matlab® y se reportaron con el umbral de significancia alcanzando los valores de p *p < 0.1, **p < 0.05. Se informan los valores de p reales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen detrás de las cifras se incluyen en los archivos de datos complementarios 1–7. Los datos de SLO procesados ​​y los videos de AOSLO y OCT sin procesar están disponibles en un repositorio público (Zenodo): https://doi.org/10.5281/zenodo.7806898. Los autores pueden solicitar datos adicionales si se solicitan de forma razonable.

Los archivos de impresión 3D de la configuración del mouse con restricción de cabeza y todos los códigos para el procesamiento de datos están disponibles en el repositorio público (GitHub): https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.

Remtulla, S. & Hallett, PE Un ojo esquemático para el ratón y comparaciones con la rata. Vis. Res. 25, 21–31 (1985).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nair, G. et al. Efectos de los anestésicos comunes sobre el movimiento ocular y el electrorretinograma. Doc. Oftalmol. Adv. Oftalmol. 122, 163–176 (2011).

Artículo Google Académico

Hawes, NL, Smith, RS, Chang, B., Davisson, M. & Heckenlively, JR Fotografía y angiografía de fondo de ojo de ratón: un catálogo de fenotipos normales y mutantes. mol. Vis. 5, 22 (1999).

Paques, M. et al. Imágenes de fondo de ojo de alta resolución mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal en el ratón. Vis. Res. 46, 1336–1345 (2006).

Artículo PubMed Google Académico

Vinck, M., Batista-Brito, R., Knoblich, U. & Cardin, JA La excitación y la locomoción hacen distintas contribuciones a los patrones de actividad cortical y la codificación visual. Neurona 86, 740–754 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chockanathan, U. et al. Los cambios en las correlaciones por pares durante la carrera remodelan el estado de la red global en el bulbo olfativo principal. J. Neurofisiol. 125, 1612-1623 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dombeck, DA, Khabbaz, AN, Collman, F., Adelman, TL y Tank, DW Imágenes de actividad neuronal a gran escala con resolución celular en ratones despiertos y móviles. Neurona 56, 43–57 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thrane, AS et al. La anestesia general interrumpe selectivamente la señalización de calcio de los astrocitos en la corteza del ratón despierto. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 109, 18974–18979 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rakymzhan, A., Li, Y., Tang, P. & Wang, RK Diferencias en la vasculatura sanguínea cerebral y el flujo en la corteza de ratones despiertos y anestesiados revelada por angiografía por tomografía de coherencia óptica cuantitativa. J. Neurosci. Métodos 353, 109094 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cang, J., Kalatsky, VA, Löwel, S. & Stryker, MP Imágenes ópticas de la señal intrínseca como medida de la plasticidad cortical en el ratón. Vis. Neurosci. 22, 685–691 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kaneko, M., Fu, Y. & Stryker, MP La locomoción induce una mejora de la respuesta específica del estímulo en la corteza visual adulta. J. Neurosci. 37, 3532–3543 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calderone, L., Grimes, P. & Shalev, M. Catarata aguda reversible inducida por xilazina y por anestesia con ketamina-xilazina en ratas y ratones. Exp. ojo Res. 42, 331–337 (1986).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xiong, J. et al. El isoflurano produce disminuciones marcadas y no lineales en los umbrales de vasoconstricción y escalofríos. Anestesiología 85, 240–245 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Geng, Y. et al. Imágenes retinianas de óptica adaptativa en el ojo de un ratón vivo. biomedicina Optar. Expreso 3, 715 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Joseph, A., Guevara-Torres, A. & Schallek, J. Obtención de imágenes del flujo sanguíneo unicelular en los vasos más pequeños a los más grandes en la retina viva. eLife 8, e45077 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guevara-Torres, A., Joseph, A. & Schallek, JB Medición sin etiquetas del flujo, la velocidad, el hematocrito y el ancho capilar de las células sanguíneas de la retina en el ojo vivo del ratón. biomedicina Optar. Express 7, 4228–4249 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Warner, EJ & Padmanabhan, K. Diferencias de sexo en el comportamiento de carrera voluntaria fija en la cabeza en ratones C57BL/6J. EUR. J. Neurosci. 51, 721–730 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Paster, EV, Villines, KA & Hickman, DL Puntos finales para modelos de tumores abdominales en ratones: refinamiento de los criterios actuales. compensación Medicina. 59, 234–241 (2009).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Barteselli, G. et al. Precisión del espectro de Heidelberg en la alineación entre la imagen del infrarrojo cercano y la exploración tomográfica en un modelo de ojo: un estudio multicéntrico. Soy. J. Oftalmol. 156, 588–592 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wang, MTM et al. Impacto del parpadeo en la superficie ocular y los parámetros de la película lagrimal. Ocul. Navegar. 16, 424–429 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Sakatani, T. & Isa, T. Análisis cuantitativo de movimientos oculares rápidos espontáneos similares a movimientos sacádicos en ratones C57BL/6. Neurosci. Res. 58, 324–331 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Yarbus, AL Eye Movements and Vision (Plenum Press, 1967).

Jeon, CJ, Strettoi, E. & Masland, RH Las principales poblaciones celulares de la retina del ratón. J. Neurosci. 18, 8936–8946 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dubra, A. & Harvey, Z. Registro de imágenes 2D de instrumentos oftálmicos de escaneo rápido. En: Registro de imágenes biomédicas, WBIR 2010, Vol 6204, (eds. Fischer, B., Dawant, BM & Lorenz, C.). Lecture Notes in Computer Science (Springer, Berlín, Heidelberg, 2010).

Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H. & Williams, DR Morfología y topografía de los pericitos retinianos en la retina de un ratón vivo utilizando imágenes de óptica adaptativa in vivo y caracterización ex vivo. investigando Oftalmol. Vis. ciencia 54, 8237 (2013).

Artículo Google Académico

Yang, Q. et al. Estabilización óptica de bucle cerrado y registro de imágenes digitales en oftalmoscopia de luz de barrido con óptica adaptativa. biomedicina Optar. Express 5, 3174–3191 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bedggood, P. y Metha, A. Análisis de las señales de movimiento y contraste generadas por los constituyentes de la sangre humana en el flujo capilar. Optar. Letón. 39, 610–613 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Irvin, CG & Bates, JHT Medición de la función pulmonar en el ratón: el desafío del tamaño. Respirar Res. 4, 4 (2003).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Butz, GM & Davisson, RL Medición telemétrica a largo plazo de parámetros cardiovasculares en ratones despiertos: una herramienta genómica fisiológica. Fisiol. Genómica 5, 89–97 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ko, H.-K., Snodderly, DM y Poletti, M. Movimientos oculares entre movimientos sacádicos: medición de la deriva ocular y el temblor. Vis. Res. 122, 93–104 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Prusky, GT, West, PWR y Douglas, RM Evaluación del comportamiento de la agudeza visual en ratones y ratas. Vis. Res. 40, 2201–2209 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, P. et al. Promedio de motas temporales de volúmenes de tomografía de coherencia óptica para imágenes retinianas vasculares y neuronales de resolución celular in vivo. Neurofotónica 6, 041105 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, X., Bedggood, P. & Metha, A. Limitaciones a la calidad de imagen de óptica adaptativa en ojos de roedores. biomedicina Optar. Expreso 3, 1811–1824 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Guevara-Torres, A., Williams, DR & Schallek, JB Obtención de imágenes de cuerpos celulares translúcidos en la retina de ratones vivos sin agentes de contraste. biomedicina Optar. Expreso 6, 2106–2119 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao-Ping, Y. et al. Evaluación ecocardiográfica de la función cardíaca en ratones conscientes y anestesiados. Soy. J. Physiol. Circo del corazón. Fisiol. 277, H1967–H1974 (1999).

Joseph, A., Chu, CJ, Feng, G., Dholakia, K. y Schallek, J. Imágenes sin etiquetas de la dinámica de las células inmunitarias en la retina viva utilizando óptica adaptativa. eLife 9, e60547 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choi, W. et al. Medición del flujo sanguíneo total pulsátil en la retina humana y de rata con OCT espectral/de dominio de Fourier de ultra alta velocidad. biomedicina Optar. Expreso 3, 1047–1061 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhi, Z., Cepurna, WO, Johnson, EC, Morrison, JC y Wang, RK Impacto de la presión intraocular en los cambios del flujo sanguíneo en la retina, la coroides y la cabeza del nervio óptico en ratas investigadas mediante microangiografía óptica. biomedicina Optar. Expreso 3, 2220–2233 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Qiu, Y., Yang, H. y Lei, B. Efectos de tres anestésicos de uso común sobre la presión intraocular en ratones. actual ojo Res. 39, 365–369 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B. & Blümel, G. Un estudio comparativo con varios anestésicos en ratones (pentobarbitona, ketamina-xilacina, carfentanilo-etomidato). Res. Exp. Medicina. 184, 159–169 (1984).

Artículo CAS Google Académico

Intoy, J. & Rucci, M. Los movimientos oculares finamente sintonizados mejoran la agudeza visual. Nat. común 11, 795 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niell, CM & Stryker, MP Campos receptivos altamente selectivos en la corteza visual del ratón. J. Neurosci. 28, 7520–7536 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ahn, J., Rueckauer, B., Yoo, Y. & Goo, YS Nuevas características de los campos receptivos en la retina del ratón a través de la covarianza desencadenada por picos. Exp. Neurobiol. 29, 38–49 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Tring, E., Duan, KK & Ringach, DL Los dominios ON/OFF dan forma a la estructura del campo receptivo en la corteza visual del ratón. Nat. común 13, 2466 (2022).

Mineault, PJ, Tring, E., Trachtenberg, JT y Ringach, DL Resolución espacial mejorada durante la locomoción y mayor atención en la corteza visual primaria del ratón. J. Neurosci. 36, 6382–6392 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Levy, DL, Sereno, AB, Gooding, DC y O'Driscoll, GA Disfunción de seguimiento ocular en la esquizofrenia: caracterización y fisiopatología. actual Arriba. Comportamiento Neurosci. 4, 311–347 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Chiu, C.-J. & Taylor, A. Hiperglucemia dietética, índice glucémico y enfermedades metabólicas de la retina. prog. Retin. ojo Res. 30, 18–53 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Srinivasan, PP, Heflin, SJ, Izatt, JA, Arshavsky, VY & Farsiu, S. Segmentación automática de hasta diez límites de capa en imágenes SD-OCT de la retina del ratón con y sin capas faltantes debido a patología. biomedicina Optar. Express 5, 348–365 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

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El laboratorio de Schallek cuenta con el respaldo del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud bajo R01 EY028293 y P30 EY001319. Padmanabhan cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01 MH113924, P50 HD103536 y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) CARRERA 1749772. La investigación también recibió el apoyo de una Subvención sin restricciones del Departamento de Oftalmología de la Universidad de Rochester, un Premio al Desarrollo Profesional, un Premio al Avance Profesional y un Premio Stein de Research to Prevent Blindness (RPB), Nueva York, Nueva York; el Premio de Neuroimagen David Mahoney de la Fundación Dana y una beca de investigación de Genentech Inc. (Schallek).

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14620, EE. UU.

Guanping Feng y Kosha Dholakia

Centro de Ciencias Visuales, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14627, EE. UU.

Guanping Feng, Aby Joseph, Kosha Dholakia, Fei Shang, Charles W. Pfeifer, Derek Power, Krishnan Padmanabhan y Jesse Schallek

Instituto de Óptica, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14620, EE. UU.

Para que José

Departamento de Neurociencia, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Fei Shang, Krishnan Padmanabhan y Jesse Schallek

Flaum Eye Institute, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

Charles W. Pfeifer y Jesse Schallek

Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo, Universidad de Rochester, Rochester, NY, 14642, EE. UU.

krishnan padmanabhan

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JS concibió este estudio. KP aportó la idea y el diseño de la preparación y configuración del ratón con restricción de cabeza. GF, AJ, KD, FS, CWP, DP y JS diseñaron y realizaron experimentos. GF, AJ y FS analizaron e interpretaron los datos. GF, AJ, KD, FS, DP y JS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Jesse Schallek.

El laboratorio fue apoyado en parte por una subvención de investigación colaborativa de Genentech Inc. Jesse Schallek posee patentes estadounidenses sobre tecnología de imágenes oftálmicas a través de la Universidad de Rochester. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a Thomas J. Gast y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Feng, G., Joseph, A., Dholakia, K. et al. Imágenes retinianas estructurales y funcionales de alta resolución en el ratón que se comporta despierto. Commun Biol 6, 572 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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Recibido: 18 mayo 2022

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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