Un mapa del tronco encefálico para las sensaciones viscerales

Nature, volumen 609, páginas 320–326 (2022)Citar este artículo

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El 14 de octubre de 2022 se publicó una corrección del editor de este artículo.

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El sistema nervioso utiliza varias estrategias de codificación para procesar entradas sensoriales. Por ejemplo, el sistema olfativo utiliza grandes repertorios de receptores y está conectado para reconocer diversos olores, mientras que el sistema visual proporciona una gran agudeza de la posición, la forma y el movimiento de los objetos1,2,3,4,5. En comparación con los sistemas sensoriales externos, los principios que subyacen al procesamiento sensorial por parte del sistema nervioso interoceptivo siguen estando poco definidos. Aquí desarrollamos una preparación de imágenes de calcio de dos fotones para comprender las representaciones de los órganos internos en el núcleo del tracto solitario (NTS), una puerta de entrada sensorial en el tronco encefálico que recibe entradas vagales y de otro tipo del cuerpo. Centrándonos en los estímulos intestinales y de las vías respiratorias superiores, observamos que las neuronas NTS individuales están sintonizadas para detectar señales de órganos particulares y están organizadas topográficamente en función de la posición del cuerpo. Además, algunas entradas mecanosensoriales y quimiosensoriales del mismo órgano convergen centralmente. Las entradas sensoriales involucran dominios NTS específicos con ubicaciones definidas, cada uno de los cuales contiene tipos de células heterogéneas. Las representaciones espaciales de diferentes órganos se agudizan aún más en el NTS más allá de lo que se logra solo con la clasificación de axones vagales, ya que el bloqueo de la inhibición del tronco encefálico amplía la sintonía neural y desorganiza las representaciones viscerales. Estos hallazgos revelan características organizativas básicas utilizadas por el cerebro para procesar entradas interoceptivas.

Los circuitos sensoriales transforman las entradas físicas básicas (fotones de luz, ondas de sonido, fuerzas químicas y mecánicas) en representaciones y percepciones de estímulos complejos. Los descubrimientos históricos han proporcionado información sobre cómo los circuitos neuronales logran estas transformaciones para nuestros sistemas sensoriales externos. Los ejemplos incluyen el mapa guiado por el receptor olfativo en el bulbo olfativo1,2, el homúnculo cortical en el sistema somatosensorial6 y los mapas del sistema visual que extraen características de estímulo cada vez más complejas a medida que asciende la información3,4,5. Por el contrario, se sabe menos sobre cómo se procesan las señales interoceptivas.

El cerebro recibe información sensorial vital de los órganos internos del cuerpo y utiliza esta información para orquestar funciones autonómicas cruciales, como la respiración, la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la motilidad intestinal, para garantizar la integridad de las vías respiratorias y modular los comportamientos de alimentación, bebida y náuseas7,8, 9,10,11,12,13,14,15. Las principales señales respiratorias, cardiovasculares y digestivas se transmiten principalmente al cerebro a través del nervio vago, que contiene docenas de tipos de neuronas sensoriales espacialmente entremezcladas en los ganglios sensoriales11,12,14,15,16. Por ejemplo, las neuronas sensoriales en el intestino detectan sustancias químicas y se estiran para informar sobre la calidad y cantidad de alimentos ingeridos, proporcionar señales de recompensa de nutrientes, orquestar el metabolismo sistémico y contribuir a la sensación de saciedad después de una comida9,10,13,15,17 . Las neuronas sensoriales vagales que inervan la laringe detectan señales químicas y mecánicas similares e inician reflejos protectores que protegen las vías respiratorias contra la aspiración12,18. Estímulos idénticos aplicados a la laringe o al tracto gastrointestinal inducen distintas respuestas fisiológicas y conductuales. Esto sugiere que la ubicación de un estímulo dentro del cuerpo es una característica clave que debe ser decodificada por los circuitos neuronales aguas abajo.

Los axones sensoriales vagales cruzan el cráneo y se dirigen principalmente al NTS, un gran centro sensorial en el tronco encefálico para la información interoceptiva y gustativa19,20. Los axones centrales de los aferentes craneales vagales y otros muestran cierta topografía en sus proyecciones NTS, como se visualiza mediante técnicas genéticas o inyección de colorante dirigida al tejido7,8,9,14,15,21,22. Por ejemplo, la información gustativa se procesa rostralmente, mientras que la información interoceptiva se procesa caudalmente19. Sin embargo, el rastreo de los tractos axónicos vagales no revela las propiedades de respuesta y las transformaciones de entrada que pueden ocurrir en las neuronas NTS, que tienen cenadores dendríticos elaborados y potencialmente contactan axones sensoriales a distancia20,23,24. Otros enfoques clásicos, como la electrofisiología in vivo y la inmunohistoquímica cFos, han brindado información importante sobre las respuestas NTS20,23,24,25,26,27. Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, estos estudios han producido conclusiones contradictorias sobre la organización de las neuronas NTS que responden a diferentes señales interoceptivas20,24,28. Aquí nos enfocamos en entradas sensoriales clásicas y bien definidas del tracto gastrointestinal y las vías respiratorias superiores para revelar las características básicas de la codificación sensorial visceral.

Desarrollamos una preparación de imágenes de calcio de dos fotones in vivo en el ratón para permitir un análisis masivamente paralelo, espacialmente resuelto y en tiempo real de las respuestas de las neuronas NTS individuales a múltiples estímulos de órganos internos. Utilizamos un indicador de calcio desplazado hacia el rojo localizado en el núcleo (jRGECO1a fusionado con la histona H2B)29,30, administrado a través de un virus adenoasociado (AAV) con un promotor que impulsa la expresión constitutiva en las neuronas. Los indicadores de calcio localizados en el núcleo se utilizan ampliamente, eliminan la señal de fondo del neuropilo y muestran amplitudes de respuesta y cinéticas compatibles con la medición de respuestas interoceptivas29,30 (Datos ampliados Fig. 1a–f). Los artefactos de movimiento cerebral impidieron la obtención de imágenes en un ratón despierto, pero fueron insignificantes bajo anestesia después de implantar una ventana craneal (Video complementario 1). La superficie dorsal del tronco encefálico se expuso después de la extirpación quirúrgica de parte del cerebelo, y se realizó una microscopía de dos fotones sobre un área y profundidad NTS caudales grandes (509 × 509 × 320 μm). Esta plataforma permitió la grabación simultánea de alrededor de 2800 neuronas y el mapeo tridimensional de representaciones de órganos (Video complementario 2).

Primero validamos las imágenes de calcio NTS al observar las respuestas a la distensión gástrica (Fig. 1a-d), un estímulo interoceptivo clásico que activa las neuronas NTS8,13. La distensión mecánica del estómago glandular a través de un globo implantado quirúrgicamente indujo transitorios de calcio en las neuronas NTS. Las respuestas fueron altamente repetibles y ocurrieron a niveles fisiológicos comparables al volumen de una comida de ratón (alrededor de 300 μl) (Fig. 1d y Datos extendidos Fig. 2a, b). Las respuestas fueron dependientes de la dosis (Fig. 1d) y la mejora de la distensión gástrica aumentó tanto el número de neuronas que respondieron como la intensidad de la respuesta en las neuronas individuales. El agrupamiento de K-medias reveló dos tipos de respuesta que podrían asignarse como de adaptación rápida o lenta, y la cinética de respuesta para neuronas individuales fue consistente en todos los ensayos (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 2). Todas las respuestas de distensión gástrica observadas en el NTS caudal se abolieron después de la vagotomía subdiafragmática bilateral (Fig. 1d), lo que indica que las respuestas observadas se transmiten por neuronas sensoriales vagales.

a, Caricaturas que representan imágenes de calcio de dos fotones NTS (izquierda) y distensión del balón gástrico (derecha). b, Imágenes representativas NTS de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a al inicio y durante el estiramiento del estómago, plano transversal. Las puntas de flecha verdes indican neuronas sensibles. M, medio; R, rostral. c, Mapas de calor que representan todas las respuestas neuronales NTS observadas (pico ΔF/F normalizado) a un estiramiento del estómago de 40 s (600 μl). El agrupamiento de k-medias definió neuronas de adaptación lenta (arriba: 548) o neuronas de adaptación rápida (abajo: 696) de 19 ratones. d, Mapa de calor que representa las respuestas de NTS (188 neuronas, 2 ratones) a la distensión gástrica (150, 300, 600 y 900 μl) antes y después de la vagotomía subdiafragmática. e, Mapa de calor que representa todas las respuestas de las neuronas NTS observadas (1133 neuronas, 6 ratones) a una serie de estímulos de distensión con globo oral (200 μl), perfusión de agua laríngea, distensión del estómago (150, 300, 600 y 900 μl), distensión del duodeno (90 , 115 y 140 μl), distensión de yeyuno (90, 115 y 140 μl) y distensión de ciego (100, 250 y 350 μl). f, Matriz de coeficiente de correlación de ΔF/F máximo para cada par de estímulos en todas las neuronas que responden a cualquier estímulo en e. g, Mapa de calor que representa todas las respuestas neuronales NTS observadas (484 neuronas, 4 ratones) a la perfusión laríngea sucesiva de alto contenido de sal (10x PBS), agua o ácido cítrico (25 mM, pH 2,6). Las respuestas son de dos intentos promediados. h, Coeficientes de correlación (R) de ΔF/F máximo para cada par de estímulos en todas las neuronas sensibles en g (izquierda, cuadro de 6 × 6) o para pares de estímulos de e que incluían agua laríngea y el estímulo de estiramiento más alto en cada órgano en todos neuronas que responden a esos estímulos (derecha, columna de 1 × 6). Barra de escala, 100 μm (b). Barras blancas, 10 s (c–e,g).

Datos fuente.

A continuación, investigamos las propiedades de ajuste de las neuronas NTS individuales mediante el examen de las respuestas a múltiples estímulos interoceptivos. El NTS visceral recibe diversos estímulos mecánicos, químicos, osmóticos y térmicos de numerosos lugares del cuerpo. Por lo tanto, inicialmente variamos la ubicación del estímulo manteniendo constante la modalidad del estímulo cuando fue posible. La posición, el tiempo y la magnitud de los estímulos mecanosensoriales pueden controlarse con precisión y aplicarse repetidamente. Por lo tanto, activamos neuronas mecanosensoriales en la cavidad oral, el estómago, el duodeno, el yeyuno y el ciego en el mismo ratón a través de la distensión tisular localizada. No se logró la distensión de la laringe debido a su pequeño tamaño en el ratón, por lo que las neuronas laríngeas se activaron a través de la perfusión de agua, una modalidad sensorial distinta que se ha caracterizado bien para activar aferentes vagales12,18,27. Se observaron respuestas para cada estímulo en el NTS caudal, con más neuronas detectando distensión estomacal, distensión duodenal o agua laríngea (aproximadamente 62%, 20% y 4% de todas las neuronas que respondieron, respectivamente). Menos neuronas respondieron a la distensión de la cavidad oral, el yeyuno o el ciego (alrededor del 1 % cada uno; Fig. 1e y Datos ampliados, Figs. 3a-e y 4). En particular, la mayoría de las neuronas sensibles (89,8 %, 1018 de 1133 neuronas, 6 ratones) fueron estimuladas selectivamente por señales que emanan de un órgano específico (Fig. 1e y Datos extendidos Fig. 3a-e). Las neuronas que respondieron a dos o más entradas de órganos se observaron de manera confiable en todos los experimentos, pero fueron raras y fueron las neuronas sintonizadas dualmente más comunes que respondieron a la distensión del estómago y el duodeno (Datos extendidos Fig. 3d). Además, incluso las neuronas que mostraron respuestas significativas a dos o más entradas de órganos generalmente respondieron con más fuerza a una de ellas (Datos extendidos Fig. 3f, g). Las respuestas neuronales a estímulos de diferente intensidad en el mismo órgano estaban más correlacionadas (R = 0,60) que las respuestas a estímulos en diferentes órganos (R = 0,10) (Fig. 1f).

Los estudios de transcriptómica unicelulares revelaron que el NTS contiene diversos tipos de células, incluidas varias clases de neuronas excitatorias e inhibidoras31. Las neuronas inhibitorias en otros sistemas sensoriales a menudo están ampliamente sintonizadas32,33. Por lo tanto, para distinguir las contribuciones de las neuronas inhibidoras y excitatorias de NTS, se midieron los transitorios de calcio en ratones Slc32a1-ires-cre (también conocidos como Vgat-ires-cre) que también contienen un alelo Gfp dependiente de Cre. Las neuronas inhibidoras se involucraron con cada estímulo de órgano interno probado y mostraron propiedades de sintonización notablemente similares a las neuronas negativas a GFP o la población global de NTS (Datos extendidos Fig. 5). Por lo tanto, las entradas sensoriales de diferentes órganos activan en gran medida conjuntos discretos de neuronas NTS tanto excitatorias como inhibidoras.

También obtuvimos la siguiente colección de nueve ratones Cre que etiquetan diferentes subpoblaciones de neuronas NTS y/o tipos de neuronas que se han relacionado previamente con funciones fisiológicas particulares: (1) Th-cre, (2) Cartpt-ires-cre, (3 ) Calcr-ires-cre, (4) Pdyn-ires-cre, (5) Tac1-ires-cre, (6) Penk-ires-cre, (7) Gcg-cre, (8) Sst-ires-cre y (9) Crhr2-ires-cre. El estiramiento del estómago y el estiramiento del intestino activaron las neuronas NTS marcadas en cada línea Cre (Datos extendidos, Fig. 6), aunque se observaron diferencias cuantitativas en algunos casos. En particular, las neuronas marcadas en ratones Crhr2-ires-cre se enriquecieron medialmente y respondieron con mayor frecuencia al estiramiento del duodeno. Por el contrario, las neuronas marcadas en ratones Th-cre se enriquecieron más lateralmente y respondieron con menos frecuencia al estiramiento del duodeno. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que diferentes entradas viscerales pueden involucrar una variedad heterogénea de tipos de células, y cada uno de estos tipos de células definidos por Cre se recluta a través de diferentes representaciones sensoriales.

A continuación, preguntamos cómo el NTS representa diferentes modalidades sensoriales del mismo órgano. Nos centramos en la laringe, lo que permitió realizar comparaciones con estudios electrofisiológicos in vivo anteriores18,27, y el intestino. Las neuronas sensoriales vagales que inervan la laringe detectan varios desafíos químicos, incluidos agua, sal y ácido, e inician reflejos protectores que protegen las vías respiratorias contra la aspiración12. Durante una sesión de imágenes NTS, se implantó una cánula debajo de las cuerdas vocales y se perfundió solución salina a través de la laringe a una velocidad lenta (500 μl min–1), lo que no desencadenó respuestas mecánicas de fondo. Se observaron respuestas neuronales NTS robustas y repetibles cuando la solución de estímulo se cambió a agua, sal alta (10x PBS) o ácido cítrico (25 mM, pH 2,6) sin alterar la velocidad de flujo. Aunque las neuronas NTS raras mostraron respuestas selectivas a estímulos laríngeos específicos (Datos extendidos Fig. 3h), la mayoría se comprometió con todos los estímulos probados (Fig. 1g, h y Datos extendidos Fig. 3h, i). Las respuestas neuronales se correlacionaron mejor entre aplicaciones repetidas del mismo (R = 0,62) o diferente (R = 0,47) estímulos laríngeos que entre agua laríngea y estímulos en otros órganos (R = 0,07). Las neuronas NTS están más sintonizadas con los estímulos laríngeos que las neuronas sensoriales vagales12,18, lo que indica una convergencia de información sensorial a medida que las señales ascienden al cerebro. La integración de señales laríngeas puede proporcionar una explicación basada en circuitos de cómo las diferentes amenazas a las vías respiratorias pueden inducir un programa motor común de defensa de las vías respiratorias.

A continuación, comparamos las representaciones NTS del estiramiento intestinal y los nutrientes intestinales, dos estímulos que inducen la sensación de saciedad9,10,13,15,17,34. La aplicación aguda de glucosa en el duodeno proximal (300 mM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS), 100 μl, puerto de salida a 1,5 cm distalmente) activó constantemente las neuronas NTS en los animales (Datos extendidos Fig. 4c). Por el contrario, HBSS solo no lo hizo, lo que sugiere que este pequeño bolo fue insuficiente para activar las neuronas mecanosensoriales. Observamos que la glucosa intestinal puede activar tanto una vía de respuesta dedicada como otras neuronas no mecanosensoriales que están sintonizadas más ampliamente, por ejemplo, a los estímulos osmóticos8,10,34. En el NTS, observamos cierta convergencia de las respuestas a la glucosa intestinal y al estiramiento intestinal; El 42,2% de las neuronas NTS sensibles a la glucosa también se activaron por la distensión del duodeno, y el 31,0% de las neuronas sensibles a la distensión del duodeno también se activaron por la glucosa (Datos ampliados, Fig. 4d). También notamos que un grupo más pequeño de neuronas NTS sensibles a la glucosa detectó distensión estomacal. Sin embargo, las neuronas sensibles a la glucosa tenían 6,8 veces más probabilidades de responder al estiramiento duodenal que al estiramiento del estómago en comparación con las neuronas NTS en general. Este resultado indica que la convergencia de la señal no es aleatoria, sino que muestra cierta selectividad de órganos. Las señales mecánicas y químicas en el duodeno activan diferentes neuronas sensoriales vagales pero se superponen a las neuronas NTS8,14,34, lo que indica una convergencia de alto nivel que surge en el tronco encefálico. Tal convergencia de señal parcial puede reflejar un diseño económico mediante el cual las neuronas polimodales median efectos fisiológicos y conductuales comunes inducidos por ambos estímulos, mientras que las neuronas NTS más selectivas preservan la discriminación de modalidad. Juntos, nuestros datos indican que el NTS contiene poblaciones neuronales en gran medida discretas que codifican estímulos de distintos órganos y, en algunos casos, conjuntos al menos parcialmente superpuestos que están involucrados en múltiples estímulos de los mismos órganos.

Además de revelar las propiedades de sintonización neuronal, las imágenes de calcio in vivo proporcionan información espacial precisa para miles de neuronas que responden en una gran región NTS en un solo experimento. En los ganglios sensoriales vagales, las neuronas que detectan entradas de diferentes órganos se entremezclan a la manera de sal y pimienta8,14. Por el contrario, observamos aquí un notable orden espacial que surge en el NTS, con neuronas cercanas que muestran propiedades de respuesta similares. Las neuronas sensibles al estiramiento del estómago se agruparon en una región NTS que estaba bordeada lateralmente por los núcleos de la columna dorsal, que respondieron a estímulos cutáneos que no activaron el NTS (Datos extendidos Fig. 7a), y a lo largo del eje anterior-posterior fueron más frecuentes cerca del límite anterior del área postrema (Fig. 2a).

a, Imágenes representativas NTS de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a (vista transversal, las imágenes están orientadas de manera similar), con neuronas codificadas por colores según las respuestas máximas al agua laríngea (100 μl), estiramiento del estómago (150, 300, 600 y 900 μl) o estiramiento duodenal (90, 115 y 140 μl). DCN, núcleos de la columna dorsal; AP, área postrema. Barra de escala, 100 μm (a). b, Las posiciones de las neuronas se grafican por tipo de respuesta. Origen del eje: centroide para las neuronas sensibles al estiramiento del estómago. Se analizó el siguiente número de neuronas y ratones: oral-estómago: 1.204 neuronas, 11 ratones; laringe-estómago: 10.610 neuronas, 57 ratones; duodeno-estómago: 28 556 neuronas, 107 ratones; yeyuno-estómago: 13.050 neuronas, 66 ratones; ciego-estómago: 415 neuronas, 9 ratones. La escala de colores representa la densidad de neuronas (Métodos). Longitud del eje, 150 μm. M, medio; R, rostral. c, Esquema que representa la ubicación relativa de diferentes dominios de respuesta de órganos en el NTS. d, Las posiciones de las neuronas se grafican por tipo de respuesta. Origen del eje: centroide de las neuronas sensibles a la glucosa duodenal (300 mM, HBSS). n = 425 neuronas (izquierda) o 97 neuronas (derecha), 2 ratones. e, Cuantificación de la segregación de neuronas en d sensibles a la glucosa del duodeno de neuronas sensibles al estiramiento del estómago o del duodeno. Media ± sem, ** P < 0,0001, prueba de Mann-Whitney de dos colas. Ver Métodos para el cálculo del índice de segregación. f, Caricatura que muestra sitios de distensión del globo en el tracto gastrointestinal. g, Las posiciones de las neuronas se grafican por tipo de respuesta y origen del eje: centroide de las neuronas sensibles al estiramiento del duodeno. Se analizó el siguiente número de neuronas y ratones: izquierda: 14.981 neuronas, 71 ratones; medio: 2846 neuronas, 53 ratones; derecha: 280 neuronas, 7 ratones. Longitud del eje, 150 μm. h, Cuantificación de la segregación de neuronas en g sensibles al estiramiento del duodeno de neuronas sensibles a otros estímulos. Media ± sem, ****P < 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Dunn siguiendo la prueba de significación de Kruskal-Wallis.

Datos fuente.

Las posiciones de las neuronas NTS sensibles al estiramiento del estómago proporcionaron un punto de referencia anatómico para comparar las ubicaciones de las neuronas sensibles a otros estímulos. Las neuronas que respondieron al estiramiento del duodeno se situaron más medialmente cerca del borde del NTS y ​​el área postrema (Fig. 2a). El análisis de la distribución espacial de todas las neuronas que respondieron selectivamente al estiramiento del estómago y el duodeno reveló una segregación del centroide de aproximadamente 60 μm por plano de visión, y la segregación se volvió más pronunciada en las regiones NTS más profundas y ventrales (Datos extendidos Fig. 7c-e ). Las posiciones relativas de las neuronas que respondían al estiramiento del estómago y el duodeno se estereotiparon, se ubicaron fácilmente en todos los animales y se conservaron a través de los anestésicos (Fig. 2a y Datos extendidos, Fig. 1g-i). Como se observa comúnmente en otros mapas cerebrales35, observamos un orden de mesoescala y cierta heterogeneidad de microescala, ya que las neuronas receptoras del estómago y del intestino se entremezclaron en el borde entre los dominios. Un análisis similar reveló que las neuronas activadas por estímulos de la cavidad oral, la laringe, el yeyuno y el ciego también estaban ubicadas aparte de las neuronas que respondían al estiramiento del estómago (Fig. 2b y Datos extendidos Fig. 7b, f). En general, las representaciones de órganos en el NTS reflejaron sus posiciones físicas dentro del cuerpo, con órganos más anteriores representados en el área más rostrolateral del NTS (Fig. 2b, c). Por lo tanto, las entradas viscerales del tracto gastrointestinal y las vías respiratorias superiores se organizan en un mapa del tronco encefálico que adopta una forma análoga a la de un homúnculo.

En contraste con la separación espacial entre las representaciones de órganos, se observó que convergen múltiples entradas de un solo órgano. Las neuronas que respondieron selectivamente a la glucosa intestinal y al estiramiento del duodeno se entremezclaron en el mismo dominio y generalmente se separaron de las neuronas que respondieron al estiramiento del estómago (Fig. 2d, e). Además, las neuronas NTS que responden al estiramiento de regiones intestinales más remotas en el yeyuno mostraron una baja separación espacial de las neuronas que responden al estiramiento duodenal, aunque las aplicaciones de estímulo del yeyuno estaban separadas entre 40 y 90 mm de los estímulos del duodeno (Fig. 2f-h). Esto contrasta marcadamente con las representaciones más segregadas del estiramiento del duodeno y el estómago, que estaban separados solo por unos 3 mm. De manera similar, las neuronas que respondieron a la distensión de diferentes regiones del estómago que estaban separadas por aproximadamente 3 mm también mostraron una separación espacial baja (Datos extendidos Fig. 7g-i). Por lo tanto, los estímulos de diferentes órganos se pueden segregar mientras que las diferentes entradas del mismo órgano pueden converger. Las señales mecanosensoriales del tracto gastrointestinal están representadas más prominentemente por órgano que por posición absoluta en el espacio, lo que sugiere que el NTS usa un mapa discreto en lugar de un mapa continuo para al menos algunos estímulos viscerales36.

Luego buscamos identificar los mecanismos que subyacen a la segregación espacial de las representaciones viscerales en el NTS. Primero, comparamos las ubicaciones de los axones sensoriales vagales de un órgano con el dominio NTS que responde a ese órgano. Se realizaron imágenes de calcio NTS en ratones en los que se visualizaron los terminales presinápticos de los axones vagales mediante la inyección de AAV1-Cag-Flex-sinaptofisina-Gfp en el estómago, el intestino o la laringe de ratones Slc17a6-ires-cre (también conocidos como Vglut2- ratones ires-cre), que permitió el acceso genético a >99% de las neuronas sensoriales vagales7. Las terminales centrales de los axones vagales de cada órgano mostraban cierta organización en el NTS, pero las neuronas del NTS que respondían a los estímulos de ese órgano no podían predecirse únicamente por la posición de las terminales de los axones correspondientes (Datos ampliados Fig. 8a-g). Las neuronas sensoriales vagales en el estómago, la laringe y el intestino incluyen varios mecanorreceptores y quimiorreceptores con diferentes patrones de orientación de NTS, por lo que obtuvimos imágenes de las respuestas de NTS mientras visualizamos simultáneamente los axones de los subtipos de neuronas sensoriales vagales definidos genéticamente. En particular, GLP1R y GPR65 etiquetan poblaciones discretas de neuronas sensoriales vagales que (1) funcionan predominantemente como mecanorreceptores y quimiorreceptores intestinales, respectivamente, y (2) muestran proyecciones NTS espacialmente discretas8. Inyectamos ratones Glp1r-ires-cre o Gpr65-ires-cre con AAV1-Cag-Flex-sinaptofisina-Gfp en el estómago y AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a en el NTS. Observamos que las neuronas sensibles al estiramiento del estómago estaban más cerca de los botones axonales de las neuronas GLP1R del estómago que las neuronas GPR65 del estómago (Datos extendidos Fig. 8h-k). Sin embargo, las posiciones de los axones vagales y el soma NTS sensible no estaban perfectamente alineados (Datos extendidos Fig. 8l). Estos hallazgos plantean la posibilidad de que el procesamiento de orden superior y la organización de dendritas en el NTS también contribuyan a la segregación de entrada.

Las neuronas inhibidoras contribuyen a agudizar las respuestas neuronales en las regiones del cerebro32,33, y las neuronas inhibidoras se distribuyen por todo el NTS (datos extendidos, figura 5). Para examinar el papel de las neuronas inhibitorias en el patrón de representaciones viscerales, primero activamos las neuronas inhibitorias en el contexto de las imágenes NTS. Inyectamos el NTS de ratones Vgat-ires-cre;Rosa26-lsl-Gfp-L10a con un AAV que contiene un gen dependiente de Cre que codifica un receptor de diseño (hM3Dq) que responde a la clozapina-N-óxido (CNO) y un segundo AAV que contiene un alelo H2b-jRGECO1a independiente de Cre. Las respuestas de NTS se registraron en neuronas GFP negativas a la estimulación visceral antes y después de la inyección de CNO en el mismo ratón. Observamos que la activación quimiogenética de las neuronas inhibidoras de NTS suprimió tanto la amplitud como la cantidad de neuronas que responden al estiramiento del estómago y el duodeno (Fig. 3a, b). Este resultado es consistente con la noción de que la inhibición local contribuye a la activación de entrada vagal37.

a, ratones Vgat-ires-cre; Rosa26-lsl-Gfp-L10a fueron inyectados en el NTS con AAV8-Syn-DIO-HA-hM3dq-ires-mCitrine y AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a. Las imágenes de NTS se realizaron en neuronas excitatorias negativas a GFP antes y después de la administración de CNO (abajo). Los ratones de control (arriba) carecían de expresión de hM3Dq y, en cambio, se les inyectó solución salina. Los mapas de calor representan las respuestas al estiramiento del estómago (150, 300, 600 y 900 μl) y al estiramiento del duodeno (90, 115 y 140 μl). n = 869 neuronas, 3 ratones (arriba) o 673 neuronas, 5 ratones (abajo). b, cambio promedio en el pico ΔF/F de las neuronas después de la inyección de solución salina o CNO. Tamaños de las muestras (de izquierda a derecha, arriba): 726 neuronas, 3 ratones; 507 neuronas, 5 ratones; (de izquierda a derecha, abajo): 94 neuronas, 3 ratones; 92 neuronas, 5 ratones. ****P < 0,0001, prueba de Mann-Whitney de dos colas. c, Mapas de calor que representan todas las respuestas NTS observadas sin (arriba a la izquierda: 16 222 neuronas, 103 ratones; arriba a la derecha: 7919 neuronas, 73 ratones) o con (abajo a la izquierda: 1168 neuronas, 5 ratones; abajo a la derecha: 1442 neuronas, 5 ratones) NTS -Administración localizada del antagonista del receptor GABAA bicuculina. Se midieron las respuestas para la distensión gástrica (150 y 300 μl), la distensión del duodeno (90, 115 y 140 μl) y la perfusión de agua laríngea (100 μl), con el pico ΔF/F de cada neurona que respondió normalizado al 100 %. Las neuronas en cada mapa de calor se ordenan por su sesgo de respuesta al estiramiento del estómago (arriba) sobre el estiramiento del duodeno/agua laríngea (abajo). d, Matrices de coeficiente de correlación de ΔF/F máximo para cada par de estímulos en todas las neuronas sensibles de c (superior: 11 795 neuronas, 73 ratones; inferior: 1806 neuronas, 5 ratones). e, Respuestas (máximo ΔF/F por encima de los umbrales; Métodos) de neuronas NTS de c. n = 400 neuronas representadas aleatoriamente por condición, 2 de 1600 fuera de rango. Barras blancas, 10 s (a,c).

Datos fuente.

A continuación, bloqueamos la inhibición al obtener imágenes de las respuestas de las neuronas NTS con o sin inyección localizada en NTS del antagonista del receptor GABAA bicuculina. El bloqueo de la inhibición amplió las respuestas de NTS, lo que provocó que muchas neuronas respondieran al estiramiento del estómago y el duodeno o tanto al estiramiento del estómago como al agua laríngea (Fig. 3c-e). El coeficiente de correlación medio entre todos los pares de estímulos de diferentes órganos aumentó de -0,12 a 0,42 en los animales tratados con bicuculina. La ampliación de la respuesta se observó de manera similar en las neuronas excitatorias e inhibidoras (Datos ampliados, Fig. 9). Como se informó antes38, el bloqueo del receptor GABAA en el NTS redujo sustancialmente la frecuencia respiratoria; tal vez el compromiso de los circuitos de control de la respiración por entradas sensoriales ectópicas contribuya a patrones de respiración alterados.

Para investigar cómo se activa naturalmente la inhibición, estiramos simultáneamente el estómago y el duodeno y comparamos sus respuestas a la distensión de cada órgano por separado. Observamos que la supresión era una característica destacada en muchas respuestas neuronales. Las respuestas a la distensión del duodeno se suprimieron consistentemente en el 29,0% de las neuronas si el estómago estaba distendido simultáneamente. Por el contrario, el estiramiento del duodeno inhibió el 17,4% de las neuronas que respondían al estómago (Fig. 4a). La supresión de la respuesta dependió de la dosis (Fig. 4b), con un mayor estiramiento del estómago que condujo a una supresión más fuerte de las respuestas del duodeno. Las neuronas propensas a la inhibición se entremezclaron con otras neuronas que respondían al mismo estímulo, sin segregación posicional aparente (Datos ampliados, Fig. 10a). Los estudios de inhibición cruzada que involucraron otros pares de órganos revelaron que la distensión gástrica suprimió de manera similar las respuestas a la distensión del yeyuno, pero fue menos eficaz para suprimir las respuestas de agua laríngea, lo que sugiere al menos cierta selectividad en la inhibición cruzada (Datos ampliados, Fig. 10). Estos hallazgos indican que las neuronas NTS muestran un marcado patrón espacial que se basa en el órgano del que reciben las señales. El patrón espacial se mejora más allá de lo que se puede lograr solo con la clasificación de axones vagales, y la inhibición lateral es una característica clave que contribuye a la sintonización selectiva de al menos algunas neuronas NTS.

a, Las respuestas de calcio se registraron en las neuronas NTS durante la aplicación sucesiva de estiramiento del estómago (600 μl), estiramiento duodenal (115 μl) y estiramiento simultáneo del estómago y el duodeno, con la serie de estímulos repetida y las respuestas promediadas. Las neuronas que detectaron selectivamente el estiramiento duodenal (izquierda, 176 neuronas) o el estiramiento del estómago (derecha, 544 neuronas) se clasificaron en dos grupos que exhibieron inhibición del estiramiento simultáneo del estómago y el duodeno (mezcla < simple; izquierda: 51 neuronas; derecha: 94 neuronas ) o no (mix ≈ single; izquierda: 125 neuronas; derecha: 450 neuronas, 5 ratones). Los trazos promedio (arriba) o los mapas de calor (abajo) de las neuronas que responden en cada clase se representan por separado, con el pico ΔF/F de cada neurona que responde normalizado al 100 %. Barra blanca, 10 s. b, Trazas representativas que muestran ΔF/F normalizado a lo largo del tiempo para neuronas individuales de a que mostraron respuestas a los seis estímulos descritos (izquierda) y otra serie de ocho estiramientos duodenales con aplicación simultánea de 0, 300, 600, 900, 900, 600, Estiramiento de estómago de 300 y 0 μl (derecha).

Los mapas neuronales son motivos de circuito característicos utilizados por varios sistemas sensoriales para representar diferentes características de estímulo4,5,6,35,39,40,41,42,43,44. La agrupación espacial de neuronas que responden de manera similar probablemente facilita y economiza el cableado del circuito neuronal45. Algunos mapas codifican la posición del estímulo, como el homúnculo somatosensorial o las representaciones de bigotes en la corteza del barril de roedores6,41; otros mapas codifican la identidad o la calidad del estímulo, como los mapas auditivos que informan sobre el tono y la estructura de los sonidos, o los mapas de color en la corteza visual40,44. Aquí, revelamos un mapa topográfico sorprendente en el tronco encefálico para las entradas viscerales del tracto gastrointestinal y la laringe, con la ubicación de las neuronas en el tronco encefálico que refleja el sitio de la sensación dentro del cuerpo. También revelamos un papel clave para la inhibición en la agudización de las respuestas NTS y ​​la amplificación del contraste entre las neuronas cercanas que transmiten distintas señales viscerales. La inhibición en otros sistemas sensoriales permite un contraste de estímulos eficiente y un control de arriba hacia abajo32. Aquí, el bloqueo de la inhibición amplía la sintonía neuronal, lo que indica que muchas neuronas NTS poseen la capacidad latente para procesar múltiples flujos de información.

El mapa NTS surge de representaciones neuronales distribuidas en ganglios vagales8,14. La génesis de la organización espacial en el tronco del encéfalo comparte similitudes con el procesamiento periférico en el sistema olfativo, en el que se distribuyen las neuronas sensoriales olfativas primarias que expresan el mismo receptor quimiosensorial, y el orden espacial surge posteriormente de novo en el bulbo olfativo1,2. Además, las respuestas de las neuronas olfatorias de segundo orden (células mitrales) están definidas principalmente por el espacio, por el glomérulo del bulbo olfatorio que inervan y el receptor olfatorio del que reciben información. Aquí mostramos que la ubicación también es un factor determinante clave en las respuestas de las neuronas NTS. Muchos estudios importantes han utilizado herramientas genéticas para delinear los tipos de células NTS10, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Aquí informamos que cada estímulo activa una variedad heterogénea de tipos de células NTS, aunque las frecuencias de los tipos de células reclutadas pueden variar según los estímulos y son particularmente notables en dos tipos de células con ubicaciones NTS regionalizadas. Por lo tanto, sugerimos que será adicionalmente importante considerar la posición de las células así como la identidad transcripcional para comprender las funciones de las neuronas NTS. Nuestros datos indican que el NTS contiene dominios definidos espacialmente para entradas sensoriales particulares, con cada dominio definido por entrada compuesto por tipos diversos y comúnmente compartidos de células definidas por transcriptomas. Nuestros hallazgos recuerdan a las cortezas somatosensorial y motora y la médula espinal, las cuales contienen diversos tipos de células distribuidas horizontalmente en columnas que corresponden a distintas áreas somatotópicas56,57,58.

A través de los sistemas sensoriales, los mapas pueden cambiar en complejidad a medida que la información asciende a través de los circuitos neuronales. Las neuronas del sistema visual extraen características de estímulo cada vez más complejas a medida que la información se transmite desde la retina a la corteza visual3,4,5. Por el contrario, el sistema olfativo forma elaborados mapas guiados por receptores en el bulbo olfativo pero descarta la estructura espacial en la corteza olfativa1,2,43. Aquí mostramos que el sistema sensorial interoceptivo también genera una notable organización espacial en el tronco encefálico. Comprender cómo se transforman los mapas y las características de codificación clave que surgen o se disipan en cada región del cerebro es esencial para determinar el papel de esa región del cerebro en los cálculos del circuito y, de manera más general, cómo el cerebro codifica la información.

Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas éticas descritas en la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y todos los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de Harvard. Los animales se mantuvieron a temperatura constante (23 ± 1 °C) y humedad relativa (46 ± 5 %) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Los ratones utilizados en este estudio eran de ambos sexos y de antecedentes genéticos mixtos. Los ratones Glp1r-ires-cre (029283), Gpr65-ires-cre (029282) y Crhr2-ires-cre (033728) se fabricaron previamente en el laboratorio y ahora están disponibles en el Laboratorio Jackson. Slc17a6-ires-cre (Vglut2-ires-cre, 028863), Slc32a1-ires-cre (Vgat-ires-cre, 028862), Rosa26-lsl-Gfp-L10a (024750), Tac1-ires-cre (021877), Ratones Pdyn-ires-cre (027958), Penk-ires-cre (025112), Cartpt-ires-cre (028533), Sst-ires-cre (013044), Th-cre (021877) y Gcg-cre (030542) se adquirieron en Jackson Laboratory.

Para construir el AAV para la expresión neuronal de jRGECO1a localizado en el núcleo (AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a), la secuencia que codifica jRGECO1a se clonó de pAAV-Syn-NES-jRGECO1a (Addgene, 100854) y se insertó en pAAV-Syn-H2b- Gcamp6f (Addgene, 74144) reemplazando la secuencia que codifica GCaMP6f. En resumen, el gen jGRECO1a se amplificó mediante PCR (cebador directo: ATAATAGGATCCACCAGTCGCCACCATGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGG; cebador inverso: ATAATAAAGCTTCTCGAGTGGATCATCTGCAGAATTCTCTAGATCGCGAACTAGTGATCCGGTCACTTCGCTGTCATCATTTGTACAAACTC). El producto de PCR jGRECO1 y pAAV-Syn-H2b-Gcamp6f se cortaron (BamHI y HindIII) y se ligaron juntos. El plásmido resultante fue secuenciado para su verificación y utilizado para preparar el virus por la Instalación de Núcleo Viral del Hospital Infantil de Boston.

Se analizaron los datos de transcriptómica publicados31 de núcleos individuales del complejo vagal dorsal de ratón (Datos extendidos Fig. 6) utilizando ocho bibliotecas con la mayor profundidad de secuenciación (31S, 20W, 34W, 14V, 36S, 40S, 39S y 25V), que correspondían a 19.481 neuronas, incluidas 13.630 neuronas NTS. Los grupos neuronales se asignaron al NTS u otras regiones caudales del tronco encefálico en función de los patrones de expresión de los genes característicos revelados en los datos de hibridación in situ de ARN del Allen Brain Atlas. Las matrices de conteo de transcripciones únicas para cada biblioteca se normalizaron mediante regresión binomial negativa regularizada con la función SCTransform en Seurat59. A continuación, se fusionaron las matrices de recuento transformadas para cada biblioteca y se realizaron análisis de componentes principales, reducción dimensional e identificación de grupos. El análisis y la visualización de datos se realizaron utilizando Seurat (v.4.0.5) en R (v.4.1.1)60,61.

Se anestesiaron ratones jóvenes (de 2 a 5 semanas de edad) (65 mg kg–1 de ketamina, 13 mg kg–1 de xilazina) y se colocaron en un marco estereotáxico para animales pequeños (David Kopf Instruments). La exposición directa al NTS causó una inflamación tisular menor pero inevitable, por lo que se accedió al NTS mediante inyección oblicua (25° desde la perpendicular, en ángulo hacia atrás). Se realizaron tres inyecciones (unilaterales) o cinco inyecciones (bilaterales) 0,36 mm, 0 mm y 0,12 mm laterales a la línea media y 4,40 mm, 4,65 mm y 4,90 mm posteriores al bregma, respectivamente. Para los ratones jóvenes, se midieron las distancias de bregma a lambda y las coordenadas de inyección a lo largo del eje rostral-caudal se escalaron para corresponder a las coordenadas para una distancia de bregma a lambda de 4,2 mm. Se bajó lentamente una pipeta de vidrio a una profundidad de 4,8 a 5,0 mm para la inyección más rostral y de 4,3 a 4,8 mm para otros sitios. Soluciones de virus que contienen AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a (0,6–1,3 × 1013 genomas por ml), AAV8-Syn-DIO-HA-hM3dq-ires-mCitrine (Addgene 50454-AAV8, 1,9 × 1013 genomas por ml), AAV1- Se inyectaron Syn-Gcamp6m (Penn Vector Core, CS1114, 7,0 × 1012 genomas por ml) o AAV9-Cag-Flex-Gfp (Addgene 51502-AAV9, 3 × 1012 genomas por ml) (150 nl por inyección, 2 nl s– 1) utilizando un inyector Nanoject III (Drummond). Los ratones se recuperaron durante 10 a 21 días antes de la obtención de imágenes funcionales. También se realizaron experimentos de control en animales inyectados con AAV a las 5 semanas de edad, y se observaron respuestas NTS similares durante las imágenes in vivo (Datos extendidos Fig. 1d-f).

AAV1-Cag-Flex-synaptophysin-Gfp fue empaquetado por el Baylor College of Medicine Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Neuroconnectivity Core Facility y el Boston Children's Hospital Viral Core Facility. Las AAV de serotipo 1 marcan retrógradamente otras neuronas sensoriales periféricas con alta eficiencia62,63,64. Se anestesiaron ratones jóvenes Vglut2-ires-cre, Gpr65-ires-cre o Glp1r-ires-cre (65 mg kg–1 de ketamina, 13 mg kg–1 de xilazina). Se expusieron el estómago y el duodeno a través de una pequeña incisión abdominal. Para el estómago, se realizaron aproximadamente 40 inyecciones (10 μl en total) de AAV1-Cag-Flex-sinaptofisina-Gfp en la pared glandular del estómago usando una jeringa Hamilton. Para el duodeno, se realizaron aproximadamente 5 inyecciones (500 nl en total, 5 nl s–1) de AAV1-Cag-Flex-sinaptofisina-Gfp en los primeros 1–1,5 cm del duodeno utilizando un inyector Nanoject III (Drummond). Se expuso la laringe a través de una pequeña incisión en la línea media en el lado ventral del cuello y se retrajo el músculo esternohioideo. Se realizaron aproximadamente 5 inyecciones (300 nl en total, 5 nl s–1) en la pared laríngea entre el borde anterior del cartílago tiroides y el primer anillo debajo del cartílago. Después de la inyección, el tejido se limpió con una esponja quirúrgica para absorber el líquido derramado. Las incisiones se cerraron con suturas y los ratones se recuperaron durante al menos 20 días antes de la obtención de imágenes de calcio.

Los ratones se anestesiaron con uretano (2 mg g–1 en 2 inyecciones intraperitoneales separadas al menos 20 min y la cirugía comenzó al menos 20 min después de la segunda inyección de uretano) o con inhalación de isoflurano (1,5–2,5 % durante todo el procedimiento, horas después de la inyección intraperitoneal inicial). inyección con 65 mg kg–1 de ketamina y 13 mg kg–1 de xilazina). La anestesia profunda se aseguró evaluando los reflejos corneales y de pellizco de la pierna durante el experimento, con uretano adicional (0.2–0.6 mg g–1) administrado según sea necesario. Los ratones se calentaron en una plataforma calentada hecha a medida y se realizó una traqueotomía para insertar un tubo de respiración. La cirugía craneal se realizó con la cabeza fija en un ángulo hacia abajo de aproximadamente 30°. Se extirparon los músculos paraespinales cervicales, exponiendo el cráneo y la primera vértebra cervical. El cráneo en la parte superior de los lóbulos cerebelosos VI-IX se cortó con un taladro dental, y la parte posterior del cerebelo y aproximadamente los lóbulos VII-X se aspiraron suavemente para exponer la superficie dorsal del tronco encefálico. Una vez que se detuvo el sangrado, se montó un poste de cabeza de titanio hecho a medida en el cráneo paralelo a la superficie del área postrema. La parte anterior del poste se fijó al cráneo con cemento adhesivo (C&B Metabond; Parkell) y la parte posterior se selló a la piel con adhesivo. Se aplicó una pequeña gota de adhesivo KwikSil (World Precision Instruments) a la superficie del tronco encefálico y se bajó una ventana craneal en forma de abanico, cortada de un cubreobjetos redondo (Warner Instruments, tamaño n.º 0, 5 mm), hasta la superficie del tronco encefálico. Se ajustó el ángulo de la ventana craneal para que quedara paralelo a la superficie del área postrema y se aplicó presión con un micromanipulador (World Precision Instruments). Se controló cuidadosamente el flujo de sangre en la vena del pedúnculo cerebeloso inferior, ya que una preparación estable libre de artefactos de movimiento requiere que se aplique suficiente presión a la ventana para impedir el flujo de sangre en este paso. La ventana craneal se fijó aún más al cráneo y al poste de la cabeza con cemento Metabond. El micromanipulador se retiró después de que endureciera el cemento, según se determinó a través de una liberación parcial de la presión sobre el cerebro de manera que el flujo sanguíneo en la vena del pedúnculo cerebeloso inferior ya no estaba obstruido. Para aumentar la tasa de éxito de la cirugía, a los ratones se les administró a menudo una inyección intravenosa de PBS (300 μl) temprano durante la cirugía y/o se les administró oxígeno a través de un cono nasal.

Las imágenes de calcio de dos fotones se realizaron con un microscopio de dos fotones de barrido resonante Olympus FVMPE equipado con un objetivo piezoeléctrico Z-stepper (P-915, Physik Instrumente) y un objetivo de inmersión en agua Olympus ×25 (NA de 1.0, WD de 8 mm). Se utilizó el software Olympus FluoView para recopilar imágenes de dos fotones. Se sintonizó un láser de Ti:zafiro con compensación de dispersión (MaiTai eHP DeepSee, SpectraPhysics) a 975–1020 nm, y la emisión de fluorescencia se filtró con un dicroico de paso largo de 570 nm y un filtro de paso de banda de 495–540 nm para las señales GFP y GCaMP6m y un filtro de paso de banda de 575 a 645 nm o de 575 a 725 nm para la señal jRGECO1a. Las imágenes volumétricas (1,25 Hz, resolución de 512 × 512 píxeles) normalmente consistían en cinco planos focales con una separación de 80 o 100 μm, cubrían una gran área NTS (509,12 × 509,12 × 320 μm) y permitían el registro simultáneo de unas 2800 neuronas por experimento. Se tomaron imágenes de las neuronas en datos extendidos Fig. 1a-c en un solo plano focal a 10-12.5 Hz. La potencia del láser medida en la apertura frontal del objetivo fue de 35 a 90 mW y dependía de la calidad de la ventana craneal y la profundidad de la imagen. Los ratones se colocaron con cuidado en las abrazaderas del poste de la cabeza para colocar en paralelo la ventana craneal y la lente frontal del objetivo del microscopio. Para garantizar que los ejes anatómicos estuvieran alineados con los detectores del microscopio, las dimensiones de guiñada y balanceo se ajustaron aún más utilizando el área postrema como punto de referencia.

Las distensiones mecánicas de los órganos se lograron inflando un globo de látex (Braintree Scientific, 73–3479 para el estómago y 73–3478 para todos los demás órganos), como se describió previamente7. Se colocó una pequeña aguja de alimentación para roedores (Cadence Science, 9920) dentro del globo y se conectó a una jeringa mediante un tubo de silicona, lo que permitió un control preciso del volumen mediante infusión de líquido. La distensión de la cavidad oral se logró inflando un globo colocado en la boca contra la base del cráneo. Para la distensión gástrica se extrajo el contenido del estómago y se realizó una pequeña incisión en la curvatura mayor del estómago glandular. El globo se hizo avanzar hacia el antro del estómago y se aseguró con una sutura alrededor del sitio de la incisión. En la Fig. 7g-i de datos ampliados, la distensión del estómago anterior implicaba el inflado de un globo implantado en el anteestómago. La distensión del duodeno se logró colocando el globo en el bulbo del duodeno a través de una incisión en el esfínter pilórico y se aseguró en el esfínter con una sutura. Para asegurarse de que los estímulos mecánicos se aislaran solo en el duodeno o el estómago, se realizó una incisión circular casi completa alrededor del esfínter pilórico y luego se ató una sutura alrededor del esfínter, lo que también evitó el derrame del contenido del estómago. Se colocaron balones de yeyuno en el intestino delgado a unos 40 mm (alrededor del ligamento de Treitz) y 90 mm distales al esfínter pilórico. Los balones de ciego se colocaron a través de una incisión en la unión del colon y el ciego y se aseguraron con una sutura. Los tubos fijados a todos los globos se aseguraron a la piel con adhesivo. Para la figura 4a, b y los datos extendidos de la figura 10, se aplicó a los ratones un tramo de estómago de 600 μl, un tramo de duodeno de 115 μl, un tramo de yeyuno de 115 μl y una perfusión de agua laríngea de 8 s antes de la toma de imágenes.

Las perfusiones laríngeas se basaron en un protocolo anterior con modificaciones12. Se realizó una traqueotomía aproximadamente cinco anillos cartilaginosos por debajo del cartílago tiroides y se avanzó una cánula (tubo PE 50, Braintree Scientific) a través del sitio de la incisión hacia la glándula tiroides. Se retiró un anillo cartilaginoso adicional entre la cánula de perfusión y el tubo de respiración para reducir la tensión. Se aplicó adhesivo de silicona Kwik-Sil adicional alrededor de la tráquea, la cánula y el tubo de respiración para asegurar sus posiciones, evitando el desplazamiento mecánico durante la estimulación, y se aplicó pegamento tisular para fijar la cánula a la piel. Para las estimulaciones de la Fig. 1g,h y las Figs. de datos extendidos. 3h, 10 y 10, se perfundió constante y lentamente PBS a través de la cánula laríngea usando una bomba peristáltica. Para la estimulación, el perfundido se cambió a alto contenido de sal (10x PBS), ácido cítrico 25 mM (pH 2,6) o agua durante 24 s (Fig. 1g,h y Datos extendidos Fig. 3h,i) o durante 8 s ( Datos extendidos Fig. 10) sin cambiar el caudal. Los intervalos entre estímulos fueron de 96 s (Fig. 1g, h y datos extendidos Fig. 3h, i) o 40 s (datos extendidos Fig. 10), y cada estímulo se repitió dos veces en el mismo ratón. Para la estimulación laríngea en otras figuras, se administró un bolo de agua de 100 μl a través de una jeringa conectada a la cánula laríngea con un tubo de silicona.

Para la aplicación de productos químicos en el duodeno, se insertaron cánulas en el bulbo del duodeno a través de una incisión en el esfínter pilórico y se aseguraron con una sutura alrededor del esfínter. Se creó un puerto de salida, hecho con tubos de silicona, 1,5 cm distal al esfínter. Se administraron estímulos que incluían solución salina (HBSS) y glucosa (0,3 M en HBSS) a través de cánulas individuales (100 μl durante 40 s). Las respuestas salinas se examinaron al final de cada sesión de imágenes para garantizar la falta de respuestas de fondo debido a la obstrucción del puerto de salida y la distensión mecánica asociada (Datos extendidos Fig. 4c, d).

El metioduro de bicuculina (Millipore-Sigma, 14343) se inyectó dos veces (cada 100 pmol en 50 nl de solución de Ringer, 3 nl s–1) usando un inyector Nanoject III, con una inyección 100 μm por debajo del obex y una segunda inyección 100 μm por debajo del superficie del tronco encefálico unos 0,3 mm más caudal y 0,3 mm más lateral al óbex. Los ratones que recibieron inyecciones de bicuculina o CNO se ventilaron mecánicamente durante el resto del experimento, y las imágenes se realizaron dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección de bicuculina. Se inyectó CNO (0,1 mg ml–1 en PBS, inyección intraperitoneal de 2 mg kg–1, Tocris) 15 minutos antes de la toma de imágenes de calcio y se excluyó 1 ratón (de 9) que no mostró apnea inducida por CNO. La vagotomía subdiafragmática (Fig. 1d) se realizó bilateralmente con tijeras de resorte (Fine Science Tools, 15000-04), con cortes realizados por encima de las ramas hepáticas de los nervios vagales izquierdo y derecho. Los experimentos de formación de imágenes de calcio se realizaron en ratones que contenían varios alelos cre y los resultados se agruparon.

El movimiento lateral se corrigió registrando la serie temporal en una imagen de referencia utilizando Suite2P y/o TurboReg65,66. Se usó una imagen promediada a lo largo de la serie temporal corregida para generar una plantilla para delinear los contornos de los núcleos neuronales marcados con jRGECO1a, que se detectaron de forma semiautomática mediante una rutina de correlación cruzada normalizada rápida como se describió anteriormente39,67. En resumen, las imágenes promediadas se correlacionaron de forma cruzada con un núcleo con un tamaño aproximado al de un núcleo promedio. Luego, la imagen se usó para generar una máscara binaria que demarcó los núcleos marcados con jRGECO1a. A continuación, la máscara se examinó visualmente y los errores se corrigieron manualmente. La intensidad de fluorescencia (Ft) se extrajo promediando la intensidad de todos los píxeles dentro de los límites de las regiones de interés. La fluorescencia inicial (F0) se determinó promediando la fluorescencia jRGECO1a durante un período de 24 s antes del inicio de la estimulación, y se determinó la desviación estándar de este período inicial previo al estímulo (s0). ΔF/F se calculó de la siguiente manera:

Se eliminaron las trazas de ΔF/F, excepto para la perfusión química duodenal, para eliminar los efectos no estacionarios como el fotoblanqueo. El umbral de respuesta (θ) de cada neurona se fijó en 2,5 × s0 + F0. Se consideró que una neurona mostraba una respuesta positiva a un estímulo mecánico si ΔF/F durante el período de estimulación estaba (1) por encima de θ durante más de tres fotogramas continuos y (2) más de dos veces la desviación estándar (s0′) por encima de la intensidad de fluorescencia promediada (F0 ') de los siete cuadros antes del inicio de la estimulación y θ para al menos dos cuadros continuos. Se consideró que una neurona mostraba una respuesta positiva a un estímulo químico si ΔF/F durante el período de estimulación más los 20 fotogramas posteriores a la compensación del estímulo estaba (1) por encima de θ durante más de cuatro fotogramas continuos y (2) más de dos veces el estándar desviación (s0″) por encima de la intensidad de fluorescencia promediada (F0″) de los 25 fotogramas antes del inicio de la estimulación y θ durante al menos dos fotogramas continuos. Las respuestas se examinaron manualmente y, en raras ocasiones (2,94 %), las respuestas se excluyeron debido a artefactos de movimiento, una desviación sustancial de la línea de base que no pudo corregirse eliminando la tendencia o por la obstrucción física de la trayectoria de la luz por los desechos. Las respuestas informadas en la Fig. 3c y los datos extendidos de la Fig. 3f, g, i fueron el máximo ΔF/F menos θ durante el período correspondiente (período de estimulación para estímulos mecánicos y período de estimulación más los 20 cuadros después de la compensación del estímulo para estímulos químicos) después del suavizado el ΔF/F utilizando un promedio móvil de cinco fotogramas. En experimentos con glucosa duodenal, se usaron campos de visión (FOV) con al menos cinco neuronas que respondían a cada estímulo para un análisis más profundo. Para todos los demás experimentos, se utilizaron FOV con al menos dos neuronas sensibles a todos los estímulos analizados.

Las distribuciones espaciales de las neuronas se representaron en relación con el centroide de todas las neuronas sensibles al estiramiento del estómago (Fig. 2b y Datos extendidos Figs. 1, 7b, d y 8), neuronas sensibles al estiramiento del sitio del estómago 2 (Datos extendidos Fig. 7h), neuronas sensibles a la glucosa duodenal (Fig. 2d), neuronas sensibles al estiramiento duodenal (Fig. 2g), neuronas positivas para jRGECO1a, negativas para Cre (datos extendidos, figura 6b), neuronas de adaptación lenta (datos extendidos, figura 2e) o neuronas no es sensible a la inhibición cruzada (datos extendidos Fig. 10) en el mismo FOV. Se generaron diagramas de dispersión de densidad (Fig. 2b, d, g y datos extendidos Figs. 1e, h, 2e, 6b, 7b, d, h, 8c, d, i, j y 10a, d, g) usando un publicado previamente algoritmo68 para revelar la segregación entre pares de estímulos. Estos gráficos incluyen neuronas que fueron activadas selectivamente por uno de los dos estímulos, y las escalas de colores representan la densidad de neuronas que respondieron selectivamente al estímulo indicado, ajustadas individualmente entre diferentes órganos. Se cuantificó la segregación espacial entre las neuronas que respondieron a dos estímulos diferentes (Datos extendidos, Fig. 7f) utilizando todas las distancias por pares entre las neuronas que respondieron al mismo estímulo o a diferentes estímulos, en comparación con los datos de una simulación en la que las respuestas de las neuronas se asignaron aleatoriamente en función de la frecuencia de respuesta observada en cada FOV (barajado) para controlar la variación regional en la densidad de neuronas. De manera similar, la segregación entre neuronas y botones (Datos extendidos Fig. 8l) se cuantificó utilizando todas las distancias por pares entre las mismas estructuras (neurona a neurona o botón a botón) o estructuras diferentes (neurona a botón) y se comparó con datos de una simulación en la que las identidades de las neuronas o los botones se asignaron aleatoriamente en función de la frecuencia de respuesta observada en cada FOV (barajado). Usamos un índice de segregación (SI) para cuantificar el grado de segregación espacial entre las neuronas que respondieron a dos estímulos diferentes (Fig. 2e, hy Datos extendidos Fig. 7e, i) dentro de los mismos conjuntos de animales. El SI se calcula para cada neurona como la diferencia entre la distancia promedio a las neuronas con diferentes respuestas y la distancia promedio a las neuronas con respuestas similares, normalizado por las distancias de las neuronas después de la combinación de respuestas, y se calculó de la siguiente manera. Dentro de la misma imagen, X, Y indican las ubicaciones de las neuronas que responden a los estímulos A y B, respectivamente. Para simplificar, escribimos Z = (X1, …, Xn, Y1, …, Ym), y sea W el conjunto de 1000 permutaciones aleatorias independientes de {1, 2, …, n + m}. El SI de las neuronas que representan el estímulo A frente a las neuronas que representan el estímulo B se calcula de la siguiente manera:

Al calcular el SI a través de múltiples imágenes, se calcularon los datos reales medios (numerador) de las neuronas en todos los experimentos antes de dividirlos por la media de los datos barajados (denominador). Para el análisis espacial de pares de estímulos, se utilizaron FOV que contenían al menos dos neuronas sintonizadas selectivamente para cada estímulo para un análisis posterior. Debido a que los tamaños de muestra eran variables en la Fig. 2b, se realizó un análisis adicional que involucró la selección aleatoria por computadora de un número igual de ratones para cada emparejamiento de estímulos y se observaron resultados similares (Datos extendidos, Fig. 7b).

Se usó un índice de enriquecimiento para cuantificar la composición relativa de los tipos de células NTS definidos por Cre que responden a cada estímulo (Datos extendidos Fig. 6d). Solo se incluyeron las neuronas que responden a cualquier estímulo; \({P}_{{{\rm{Cre}}}^{+}}\) es el porcentaje de neuronas Cre positivas que responden al estímulo A, y \({P}_{{{\rm{Cre }}}^{-}}\) es el porcentaje de neuronas Cre negativas que responden al estímulo A dentro del mismo grupo de animales; el índice de enriquecimiento se calculó de la siguiente manera:

Para la Fig. 4a, las respuestas se midieron en el siguiente orden: distensión estomacal (dS1), distensión duodenal (dD1), distensión estomacal y duodenal simultánea (dM1), segunda distensión estomacal (dS2), segunda distensión duodenal (dD2) y segunda distensión duodenal simultánea. distensión estomacal y duodenal (dM2). Una neurona se clasificó como suprimida por la mezcla de estímulos solo si se cumplían los siguientes criterios: (1) dM1 < dD1, (2) dM2 < dD2 y (3) (dM1 + dM2)/2 < dD2 para respuestas de duodeno; o (1) dM1 < dS1, (2) dM2 < dS2 y (3) (dM1 + dM2)/2 < dS2 para respuestas estomacales69. Se realizaron los mismos análisis para los experimentos de inhibición cruzada que involucraban agua laríngea y distensión del yeyuno en los datos extendidos de la Fig. 10. El análisis por ratón involucró la cuantificación de la respuesta separada de las neuronas que fueron o no suprimidas por las mezclas de estímulo, e incluyó a todos los animales en los que tanto la respuesta Se observaron tipos.

Para la Fig. 8 de datos extendidos, la fluorescencia débil de H2B-jRGECO1a en el canal verde se eliminó computacionalmente y mediante curación manual. Los bordes de las señales de GFP residuales se detectaron utilizando el algoritmo de detección de bordes de Canny, y los centroides de cada botón positivo de GFP se determinaron y curaron manualmente por un experimentador que desconocía las propiedades de respuesta neuronal o la orientación de la imagen. Las áreas de inervación fueron determinadas manualmente por un experimentador cegado a las respuestas neuronales y al sitio de inyección del marcador. El análisis se realizó en el plano focal en una pila de imágenes con las respuestas neuronales más segregadas. Los datos de neuronas multisintonizadas que respondieron a más de un estímulo se incluyeron en todos los grupos de estímulos correspondientes. Todos los análisis se realizaron ciegos a las respuestas neuronales en el FOV.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software), con pruebas estadísticas y tamaños de muestra informados en las leyendas de las figuras. Todas las réplicas son biológicas y todas las pruebas estadísticas son de dos colas. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, que se basaron en experiencias previas y publicaciones en nuestro campo8,14,34. Los investigadores no estaban cegados a la asignación de grupos, excepto para la determinación manual de la inervación del axón (datos ampliados, figura 8), que se realizó de forma ciega a la asignación de grupos y las respuestas neuronales. No se usó ningún método de aleatorización para determinar cómo se asignaron los animales a los grupos experimentales en la Fig. 3 y en la Fig. 1d-i de datos extendidos, y todos los demás análisis involucraron comparaciones de estímulos en los mismos animales. En las Figs. 1f, hy 3b, los coeficientes de correlación de Pearson se calcularon para cada par de estímulos comparando los valores máximos de ΔF/F en todas las neuronas que responden a cualquier estímulo en las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de imágenes sin procesar están disponibles a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Seurat (4.0.5), R (4.1.1), ImageJ (1.52q), Matlab (R2020a), Processing (4.0a3), Python (3.9.4), OpenCV (4.5.1) y GraphPad Prism (9.0. 2) se utilizaron para los análisis de datos. Todo el código generado estará disponible a pedido razonable.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05414-5

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Agradecemos a S. Arber por proporcionar el vector pAAV-Cag-Flex-sinaptofisina-Gfp; R. Brust, Y. Wang, J. Zhu, G. Mahler y el personal del centro central de imágenes celulares del Boston Children's Hospital por su ayuda con los experimentos; y Q. Zhao, W. Su, M. Schappe, S. Prescott, C. Zhang y M. Hayashi por sus comentarios sobre el manuscrito. El trabajo fue respaldado por subvenciones de los NIH a SDL (DP1 AT009497, R01 DK122976 y R01 DK103703), la Iniciativa científica sobre alergias alimentarias y una beca posdoctoral Leonard e Isabelle Goldenson, un premio de transición para investigadores jóvenes de la Iniciativa científica del cerebro de Harvard y una Asociación Estadounidense de Diabetes. Postdoctoral Fellowship to CRSDL es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Departamento de Biología Celular, Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Chen Ran, Jack C. Boettcher, Judith A. Kaye, Catherine E. Gallori y Stephen D. Liberles

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CR y SDL diseñaron los experimentos. CR realizó todos los experimentos. CR, JCB y CEG analizaron las imágenes específicas del tipo de célula y los datos de rastreo del axón vagal. JAK analizó los datos de secuenciación de ARN de un solo núcleo. CR analizó todos los demás experimentos. CR y SDL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Stephen D. Liberles.

SDL es consultor de Kallyope. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature agradece a Alexander Chesler, Ulrika Marklund y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, los ratones se inyectaron en el NTS con AAV que codifican H2B-jRGECO1a y GCaMP6m, y luego se realizaron imágenes de NTS para medir los transitorios de calcio provocados por la distensión gástrica. Un mapa de calor que muestra las respuestas resueltas en el tiempo de las 74 neuronas NTS (2 ratones) que muestran las respuestas H2B-jRGECO1a (izquierda) y GCaMP6m (derecha) a una serie de distensiones gástricas (barras verdes de grosor creciente: 150, 300, 600 , y 900 μl), barra blanca: 10 s. b, Trazas representativas que representan ΔF/F normalizado a lo largo del tiempo para neuronas individuales (las mismas neuronas a la izquierda y a la derecha), barra de escala: 10 s. c, ΔF/F máximo de neuronas NTS que responden a 900 μl de distensión gástrica. d, a los ratones se les inyectó en el NTS un AAV que codifica H2B-jRGECO1a a las 2 (izquierda) y 5 (derecha) semanas de edad, y más tarde se realizaron imágenes de NTS. Imágenes representativas de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a en el NTS (vista transversal). Las neuronas están codificadas por colores en función de sus amplitudes de respuesta pico relativas por encima del umbral al agua laríngea (azul, 100 μl), estiramiento del estómago (verde, respuesta máxima a 150, 300, 600 o 900 μl) o estiramiento duodenal (rojo, pico respuesta a 90, 115 o 140 μl), barra de escala: 100 μm. e, Las posiciones de las neuronas que responden selectivamente a los estímulos indicados se grafican con el origen del eje correspondiente al centroide para las neuronas que responden al estiramiento del estómago, arriba a la izquierda: 695 neuronas, 4 ratones, abajo a la izquierda: 1106 neuronas, 4 ratones, arriba a la derecha: 2331 neuronas, 8 ratones, abajo a la derecha: 2215 neuronas, 6 ratones, la escala de colores representa la densidad neuronal (ver métodos), longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. f, cuantificación del porcentaje de neuronas sintonizadas individualmente para distensión gástrica, distensión duodenal o agua laríngea, puntos: ratones individuales, n: 4 (izquierda), 8 (derecha), media ± sem. g, Imágenes representativas de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a en el NTS (vista transversal) de ratones anestesiados con uretano (2,2–2,6 mg/mg) o isoflurano (1,5 %–2,5 %). Las neuronas están codificadas por colores en función de sus amplitudes de respuesta pico relativas por encima del umbral al agua laríngea (azul, 100 μl), estiramiento del estómago (verde, respuesta máxima a 150, 300, 600 o 900 μl) o estiramiento duodenal (rojo, pico respuesta a 90, 115 o 140 μl), barra de escala: 100 μm. h, Las posiciones de las neuronas que responden selectivamente a los estímulos indicados se representan con el origen del eje correspondiente al centroide para las neuronas que responden al estiramiento del estómago, arriba a la izquierda: 1136 neuronas en 8 ratones seleccionados al azar de 49 ratones, abajo a la izquierda: 2525 neuronas en 9 ratones seleccionados al azar de 98 ratones, arriba a la derecha: 1010 neuronas, 8 ratones, abajo a la derecha: 1707 neuronas, 9 ratones, la escala de colores representa la densidad neuronal (ver métodos), longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. i, cuantificación del porcentaje de neuronas sintonizadas individualmente para distensión gástrica, distensión del duodeno o agua laríngea, puntos: ratones individuales, n: 63 (izquierda), 10 (derecha), media ± sem.

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a, Mapa de calor que representa las respuestas resueltas en el tiempo (codificadas por colores según el porcentaje de aumento en ΔF/F de fluorescencia jRGECO1a desde el inicio) de las 81 (1 ratón) neuronas NTS que respondieron a diez distensiones gástricas consecutivas (barras verdes). Cada fila muestra la respuesta de una neurona individual, con filas ordenadas por amplitud de respuesta, barra blanca: 10 s. b, Una gráfica ordenada por rango de pico ΔF/F para las 81 neuronas representadas en la Fig. 1c, círculos grises: amplitudes de respuesta máxima de ensayos individuales; círculos rojos: medias de las amplitudes de respuesta máximas a lo largo de las pruebas. c, Rastros representativos que representan ΔF/F normalizado a lo largo del tiempo para neuronas individuales para estiramiento repetido del estómago (600 μl, tasa de distensión: ~25 μl/s para los ensayos n.° 1 y n.° 3, y ~300 μl/s para los ensayos n.° 2 y n.° 4), barra de escala: 10 s. d, un histograma que representa la duración de la respuesta (ancho completo en un cuarto de máximo) de neuronas de adaptación lenta (verde) y de adaptación rápida (amarilla) en la Fig. 1c. e, Una imagen representativa de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a en el NTS (vista transversal) con neuronas pseudocoloreadas en función de su adaptación lenta (verde) o rápida (amarilla) al estiramiento del estómago, barra de escala: 100 μm. f, Posiciones de las neuronas que se adaptan lentamente (verde, 544 neuronas) o rápidamente (amarillo, 650 neuronas) al estiramiento del estómago, con el origen del eje correspondiente al centroide para las neuronas de adaptación lenta, 19 ratones, la escala de colores representa la densidad neuronal (ver métodos) , longitud del eje: 200 μm, R: rostral, M: medial. g, Porcentaje de neuronas activadas por el estiramiento del estómago de adaptación lenta (verde, 289 neuronas en 13 ratones) y de adaptación rápida (amarillo, 493 neuronas en 13 ratones) que también respondieron al estiramiento del duodeno (90, 115 o 140 μl). h, Respuestas de las neuronas de adaptación lenta (verde, 316 neuronas en 13 ratones) y de adaptación rápida (amarilla, 518 neuronas en 13 ratones) a diversas magnitudes de distensión gástrica; ΔF/F máximo normalizado al 100% para cada neurona, media ± sem.

Datos fuente

a, Trazas representativas que representan ΔF/F normalizado a lo largo del tiempo para neuronas individuales de la Fig. 1e. b, El porcentaje de neuronas de la Fig. 1e que responden selectivamente a diferentes entradas de órganos o muestran respuestas multisintonizadas. c, Gráfico circular que representa las neuronas de la Fig. 1e que responden a los estímulos de 1 (sintonizado único) o > 1 (sintonizado múltiple) órgano. d, el porcentaje de neuronas multisintonizadas en la Fig. 1e para varios pares de estímulos. e, El porcentaje de neuronas sintonizadas individualmente en cada ratón fotografiado (círculos) de la Fig. 1e, media ± sem. f, Respuestas (ΔF/F máximo por encima de los umbrales) de las neuronas que respondieron a cualquier estiramiento del estómago y/o cualquier estimulación en otros órganos. Cada gráfico muestra las respuestas de 300 neuronas seleccionadas al azar de 3815 neuronas, 21 ratones (oral frente a estómago), de 18895 neuronas, 73 ratones (laringe frente a estómago), de 35120 neuronas, 113 ratones (duodeno frente a estómago), de 21653 neuronas, 84 ratones (yeyuno frente a estómago), y de 4414 neuronas, 22 ratones (ciego frente a estómago). g, Respuestas (ΔF/F máximo por encima de los umbrales) de neuronas que respondieron a 600 ml o 900 ml de estiramiento del estómago (300 neuronas seleccionadas al azar de 27125 neuronas, 103 ratones). h, Trazas representativas que representan ΔF/F normalizado a lo largo del tiempo para 13 neuronas individuales de la Fig. 1g, barra de escala: 10 s. i, Respuestas (máximo ΔF/F por encima de los umbrales, ver métodos) de 362 (izquierda), 404 (centro) y 467 (derecha) neuronas NTS sensibles de la Fig. 1g. Las respuestas máximas fueron de un ensayo (izquierda) o fueron la respuesta más grande de dos ensayos (centro, derecha).

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a, mapas de calor que representan las respuestas resueltas en el tiempo de todas las neuronas NTS que respondieron a varias magnitudes de estiramiento del duodeno (arriba, 271 neuronas) y estiramiento del yeyuno (abajo, 118 neuronas), 6 ratones, barra blanca: 10 segundos. b, pico ΔF/F de neuronas en a que respondieron a los estímulos indicados, prueba F para pendiente distinta de cero: ****P < 0,0001. c, Mapa de calor que representa las respuestas resueltas en el tiempo de las 74 neuronas NTS que respondieron (2 ratones) a la perfusión duodenal (24 s) de glucosa (300 mM en HBSS, púrpura) y solución salina (HBSS, oliva), barra de escala: 10 s . d, Mapa de calor que representa las respuestas resueltas en el tiempo de las 492 neuronas NTS que respondieron (2 ratones) a la perfusión duodenal de glucosa (300 mM, púrpura oscuro), estiramiento del duodeno (rojo: 140 μl) y estiramiento del estómago (600 μl, verde ), barra blanca: 10 s.

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ac, se inyectaron ratones Vgat-ires-Cre en el NTS con AAV9-Cag-Flex-Gfp y AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a y se prepararon para imágenes de dos fotones in vivo. a, Se muestra una imagen representativa de la fluorescencia nativa de H2B-jRGECO1a (magenta) y GFP (verde, que representa las neuronas Vgat), barra de escala: 100 μm. Se realizaron ajustes de imagen no lineales para garantizar la visualización de todas las celdas verdes. b, Mapa de calor que representa las respuestas resueltas en el tiempo de todas las neuronas NTS que respondieron 1933 Vgat negativas (izquierda) y 206 Vgat positivas (derecha) en 7 ratones a la perfusión de agua laríngea (azul oscuro), estiramiento del estómago (verde, grosor creciente: 150, 300, 600 y 900 μl) y distensión de duodeno (rojo, espesor creciente: 90, 115 y 140 μl), barra blanca: 10 s. c, Gráficos circulares que representan los porcentajes de neuronas Vgat negativas y Vgat positivas que responden a los estímulos indicados. df, los ratones Vgat-ires-Cre se cruzaron con ratones Rosa26-lsl-Gfp-L10a y se prepararon para obtener imágenes de dos fotones in vivo. d, se muestra una imagen representativa de la fluorescencia nativa de H2B-jRGECO1 (magenta) y GFP (verde, que representa las neuronas Vgat), barra de escala: 100 μm. Se realizaron ajustes de imagen no lineales para garantizar la visualización de todas las celdas verdes. e, Mapa de calor que representa las respuestas resueltas en el tiempo de las 766 neuronas Vgat negativas (izquierda) y las 402 Vgat positivas (derecha) que responden a las neuronas NTS en 5 ratones a la perfusión de agua laríngea (azul oscuro), estiramiento del estómago (verde, grosor creciente: 150, 300, 600 y 900 μl) y distensión de duodeno (rojo, espesor creciente: 90, 115 y 140 μl), barra blanca: 10 s. f, Gráficos circulares que representan los porcentajes de neuronas Vgat negativas y Vgat positivas que responden a los estímulos indicados.

a, se realizaron imágenes de NTS en ratones que contenían un alelo Gfp dependiente de Cre y se indicaron los alelos Cre. Imágenes representativas de fluorescencia nativa H2B-jRGECO1 (magenta) y GFP (verde), ajustes de imagen no lineales realizados para garantizar la visualización de todas las celdas verdes, barra de escala: 100 μm. b, Posiciones de las neuronas positivas para GFP, positivas para H2B-jRGECO1a (verde) y negativas para GFP, positivas para H2B-jRGECO1a (magenta), con el origen del eje correspondiente al centroide de las neuronas positivas para H2B-jRGECO1a negativas para GFP. Número de neuronas verdes/rojas de 5 ratones Th-Cre: 354/11748, 3 ratones Cartpt-ires-Cre: 106/8235, 4 ratones Calcr-ires-Cre: 756/6911, 3 ratones Pdyn-ires-Cre: 1 /6747, 7 ratones Tac1-ires-Cre: 456/15016, 4 ratones Penk-ires-Cre: 1326/8635, 3 ratones Gcg-Cre: 478/11122, 3 ratones Sst-ires-Cre: 812/7149 y 5 ratones Crhr2-ires-Cre: 398/14377, la escala de colores representa la densidad neuronal (ver métodos), longitud del eje: 200 μm, R: rostral, M: medial. c, Gráficos circulares que representan los porcentajes de neuronas GFP negativas, H2B-jRGECO1a positivas (arriba) y GFP positivas, H2B-jRGECO1a positivas (abajo) que responden al estiramiento del estómago, estiramiento del duodeno o ambos (afinación múltiple) . d, un índice de enriquecimiento cuantifica la composición relativa de los tipos de células NTS definidos por Cre que responden a cada estímulo (ver Métodos). e, Gráfica de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP) que indica los subtipos de neuronas NTS según los datos publicados del transcriptoma unicelular31. f, Gráficos de puntos que muestran la expresión normalizada de genes indicados en 24 subtipos de neuronas NTS de e.

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a, Imagen representativa de dos fotones de fluorescencia H2B-jRGECO1a en el NTS (vista transversal), con neuronas codificadas por colores según sus amplitudes de respuesta pico relativas por encima del umbral para pellizcar la pierna (rojo) y estirar el estómago (verde, sucesivos 150, 300 , distensiones de 600 y 900 μl), barra de escala: 100 μm. b, Las posiciones de las neuronas que responden selectivamente a los estímulos indicados se representan como en la Fig. 3b, con un análisis que aquí involucra a 9 ratones seleccionados al azar de la Fig. 3b para igualar el tamaño de la muestra, oral/estómago: 925 neuronas, laringe/estómago: 1128 neuronas, duodeno /estómago: 2347 neuronas, yeyuno/estómago: 1153 neuronas, ciego/estómago: 415 neuronas (los mismos datos que en la Fig. 3b), la escala de colores representa la densidad de las neuronas (ver métodos), longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medio. c, Imágenes representativas de dos fotones a varias profundidades de fluorescencia H2B-jRGECO1a en el NTS (vista transversal), con neuronas codificadas por colores en función de sus amplitudes de respuesta pico relativas por encima del umbral para estirar el estómago (verde, 150, 300, 600, y distensiones de 900 μl) y estiramiento de duodeno (rojo, distensiones sucesivas de 90, 115 o 140 μl), barra de escala: 100 μm. d, Las posiciones de las neuronas a varias profundidades que responden selectivamente a los estímulos como se describe en c se representan con el origen del eje correspondiente al centroide para las neuronas que responden al estiramiento del estómago, 0 μm: 455 neuronas, 17 ratones, 80 μm: 2517 neuronas, 46 ratones, 160 μm: 4909 neuronas, 53 ratones, 240 μm: 4445 neuronas, 52 ratones, 320 μm: 2204 neuronas, 39 ratones, la escala de colores representa la densidad neuronal, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. e, cuantificación de la segregación espacial de las neuronas en d, media ± sem, consulte los métodos para el índice de segregación. f, Distancias por pares entre neuronas que responden al mismo estímulo (en color) oa diferentes estímulos (en negro). Los datos de la Fig. 3b (reales) se compararon con los datos de una simulación en la que las respuestas de las neuronas se asignaron aleatoriamente en función de la frecuencia de respuesta observada en cada campo de visión (mezclado) para controlar la variación regional en la densidad de neuronas, oral/estómago: 1204 neuronas , 11 ratones, laringe/estómago: 10610 neuronas, 57 ratones, duodeno/estómago: 28556 neuronas, 107 ratones, yeyuno/estómago: 13050 neuronas, 66 ratones, ciego/estómago: 415 neuronas, 9 ratones, media ± sem, ## ##P < 0,0001, interacción significativa en el análisis de varianza bidireccional entre los tipos de respondedores y el barajado, ****P < 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Šídák. g, Caricatura que muestra sitios de distensión del globo en el tracto gastrointestinal. h, Las posiciones de las neuronas que responden a los estímulos indicados se grafican en relación con el centroide (origen de las coordenadas) de las neuronas que responden a la distensión del sitio 2 del estómago, izquierda: 1155 neuronas, 4 ratones, derecha: 927 neuronas, 4 ratones, longitud del eje: 150 μm , R: rostral, M: medial. i, cuantificación de la segregación espacial de neuronas en h en respuesta a los estímulos indicados, media ± sem, ****P < 0,0001, prueba de Mann-Whitney de dos colas, consulte los métodos para el índice de segregación.

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a, Caricatura que representa imágenes de dos fotones NTS en ratones Vglut2-ires-Cre inyectados con AAV1-Cag-Flex-Synaptophysin-Gfp en la laringe (arriba), estómago (medio) y duodeno (abajo), y AAV1-Syn- H2b-jRGECO1a en el NTS. b, Izquierda: imágenes representativas de dos fotones (vista transversal) de núcleos neuronales NTS (rojo, jRGECO1a) y botones de axones vagales de los órganos indicados (verde, sinaptofisina-GFP). Derecha: las mismas imágenes con neuronas NTS codificadas por colores en función de sus amplitudes de respuesta pico relativas por encima del umbral al agua laríngea (100 μl, azul), estiramiento del estómago (verde, distensiones sucesivas de 150, 300, 600 y 900 μl) y duodenal estiramiento (rojo, distensiones sucesivas de 90, 115 y 140 μl), R: rostral, M: medial, barra de escala: 100 μm. c, Posiciones de los botones del axón vagal de la laringe (fila superior, azul oscuro, 489 botones, 3 ratones), estómago (fila del medio, verde oscuro, 966 botones, 3 ratones) y duodeno (fila inferior, rojo oscuro, 891 botones , 5 ratones) se representan junto con las posiciones de las neuronas NTS que responden selectivamente a 100 μl de agua laríngea (columna izquierda, azul), cualquier distensión (150, 300, 600 o 900 μl) del estómago (segunda columna izquierda, verde), cualquier distensión (90, 115 o 140 μl) de duodeno (segunda columna derecha, rojo) o cualquier distensión (90, 115 o 140 μl) de yeyuno (columna derecha, naranja). Neuronas representadas de arriba a abajo: laringe 24, 54, 57, estómago 209, 364, 555, duodeno 91, 92, 109, yeyuno 69, 59, 58, origen del eje: centroide para neuronas sensibles al estiramiento del estómago, longitud del eje: 150 μm , R: rostral, M: medial. d, Posiciones de los botones del axón vagal desde c con el origen del eje correspondiente al centroide para las neuronas sensibles al estiramiento del estómago, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. e, Los porcentajes de botones de axones vagales de la laringe (arriba), el estómago (medio) y el duodeno (abajo) en c que están ubicados dentro de un radio variable desde cualquier neurona que responda a los estímulos indicados, media ± sem. f, Distancias entre las neuronas NTS que responden a los estímulos indicados y los botones más cercanos de los axones vagales de la laringe (arriba), el estómago (medio) y el duodeno (abajo), media ± sem. g, Porcentajes de neuronas NTS que responden a estímulos indicados que están ubicados en el área de inervación (ver métodos) de axones vagales de diferentes órganos. h, Izquierda: imágenes representativas de dos fotones (vista transversal) de núcleos neuronales NTS (rojo, jRGECO1a) y botones de axones vagales (verde, Sinaptofisina-GFP) visualizados inyectando AAV1-Cag-Flex-Sinaptofisina-Gfp en el estómago de Ratones Vglut2-ires-Cre (arriba), Glp1r-ires-Cre (medio) o Gpr65-ires-Cre (abajo), barra de escala: 100 μm. Derecha: las mismas imágenes con las neuronas NTS coloreadas en verde para indicar las neuronas que responden a la distensión del estómago. i, Posiciones de los botones axonales (verde oscuro) de las neuronas estomacales etiquetadas en Vglut2-ires-Cre (superior, 966 botones, 3 ratones, mismos datos que c), Glp1r-ires-Cre (centro, 1276 botones, 3 ratones), o ratones Gpr65-ires-Cre (abajo, 243 botones, 3 ratones) y en comparación con las posiciones de las neuronas NTS que responden al estiramiento del estómago, origen del eje: centroide para las neuronas que responden al estiramiento del estómago, arriba: 364 neuronas (los mismos datos que c) , medio: 539 neuronas, inferior: 244 neuronas, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. j, Posiciones de boutons axonales de i. k, Distancias entre las neuronas NTS que responden al estiramiento del estómago y los botones más cercanos de los axones vagales del estómago de ratones Vglut2-ires-Cre (los mismos datos que en f), Glp1r-ires-Cre y Gpr65-ires-Cre, media ± sem, **P < 0,01, ****P < 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Dunn siguiendo la prueba de significación de Kruskal-Wallis. l, Las distancias por pares se calcularon entre las neuronas NTS que responden al estiramiento del estómago y los botones axonales de las neuronas del estómago de las líneas Cre indicadas (negras) y se compararon con un promedio de distancias por pares botón-botón y diferencias por pares de neuronas NTS-neuronas NTS (verde). Los datos reales se compararon con los datos de una simulación en la que la identidad de la neurona bouton o NTS se asignó aleatoriamente en función de la frecuencia observada en cada campo de visión (mezclado) para controlar la variación regional en la densidad de neuronas o bouton, media ± sem, ###P < 0,001, ####P < 0,0001, interacción significativa en el análisis de varianza bidireccional entre los tipos de respondedores y barajar, ****P < 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Šídák.

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a, Vgat-ires-Cre; Se inyectaron ratones Rosa26-lsl-Gfp-L10a en el NTS con AAV1-Syn-H2b-jRGECO1a, y se realizaron imágenes de NTS in vivo con (abajo) o sin (arriba) administración de bicuculina localizada en NTS. Los mapas de calor representan las respuestas resueltas en el tiempo de las neuronas Vgat-positivas (izquierda) y Vgat-negativas (derecha) al agua laríngea (azul oscuro, 100 μl), estiramiento del estómago (verde, grosor creciente: 150, 300, 600 y 900 μl) y/o distensión del duodeno (rojo, aumento de espesor: 90, 115 y 140 μl). Arriba: 402 neuronas Vgat positivas y 766 Vgat negativas, 5 ratones, los mismos datos que los datos extendidos Fig. 5e; abajo: 365 neuronas Vgat-positivas y 851 Vgat-negativas, 2 ratones, barra blanca: 10 s. b, Gráficos circulares que representan los porcentajes de neuronas Vgat-positivas (izquierda) y Vgat-negativas (derecha) de c que responden a los estímulos indicados con (abajo) o sin (arriba, los mismos datos que los datos extendidos Fig. 5f) administración de bicuculina. c, El porcentaje de neuronas Vgat-positivas y Vgat-negativas de una respuesta a estímulos de > 1 órgano (multi-tuned), ****P < 0,0001, prueba de χ2 de dos colas.

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a, Posiciones de las neuronas de la Fig. 4a que responden selectivamente al estiramiento del duodeno (arriba) o del estómago (abajo), con coloración diferencial basada en la sensibilidad a la inhibición lateral, origen del eje: centroide para neuronas no inhibidas, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medial. b, Supresión de respuesta en pares de estímulos indicados medidos por animal en neuronas que recibieron inhibición provocada por estimulación dual (Mix < single, right) o no (Mix ≈ single, left), puntos de datos: cambios de respuesta promedio de todos neuronas en un solo ratón, 5 ratones. c, Trazas promedio (arriba) o mapas de calor (abajo) de respuestas de neuronas NTS normalizadas y resueltas en el tiempo a la aplicación sucesiva de estiramiento estomacal (verde, 600 μl), estiramiento yeyunal (amarillo, 115 μl) y ambos. Las neuronas que detectaron selectivamente estiramiento del yeyuno (izquierda, 378 neuronas) o estiramiento del estómago (derecha, 1183 neuronas) se clasificaron en dos grupos: inhibición provocada por estimulación dual (Mezcla < simple; izquierda: naranja, 125 neuronas, derecha: verde claro, 124 neuronas ) o no (Mix ≈ single; izquierda: gris, 253 neuronas, derecha: verde oscuro, 1059 neuronas, 8 ratones), barra blanca: 10 s. d, Posiciones de las neuronas de c que responden selectivamente al estiramiento del yeyuno (izquierda) o del estómago (derecha), con coloración diferencial basada en la sensibilidad a la inhibición lateral, origen del eje: centroide para neuronas no inhibidas, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medio. e, Supresión de respuesta en pares de estímulos indicados medidos por animal en neuronas que recibieron inhibición evocada por estimulación dual (Mix < single, right) o no (Mix ≈ single, left), puntos de datos: cambios de respuesta promedio de todos neuronas en un solo ratón, 7 ratones. f, Trazas promedio (arriba) o mapas de calor (abajo) de respuestas de neuronas NTS normalizadas y resueltas en el tiempo a la aplicación sucesiva de estiramiento estomacal (verde, 600 μl), agua laríngea (azul) y ambos. Las neuronas que detectaron selectivamente agua laríngea (izquierda, 119 neuronas) o estiramiento del estómago (derecha, 243 neuronas) se clasificaron en dos grupos: inhibición provocada por estimulación dual (Mezcla < simple; izquierda: azul claro, 13 neuronas, derecha: verde claro, 37 neuronas) o no (Mix ≈ simple; izquierda: azul oscuro, 106 neuronas, derecha: verde oscuro, 206 neuronas, 3 ratones), barra blanca: 10 s. g, Posiciones de las neuronas de f que responden selectivamente al agua laríngea (izquierda) o al estiramiento del estómago (derecha), con coloración diferencial basada en la sensibilidad a la inhibición lateral, origen del eje: centroide para neuronas no inhibidas, longitud del eje: 150 μm, R: rostral, M: medio. h, Supresión de respuesta en pares de estímulos indicados medidos por animal en neuronas que recibieron inhibición provocada por estimulación dual (Mix < single, right) o no (Mix ≈ single, left), puntos de datos: cambios de respuesta promedio de todos neuronas en un solo ratón, 3 ratones, media ± sem, *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Šídák.

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Imágenes NTS in vivo en el mismo ratón con (izquierda) o sin (derecha) anestesia con isoflurano.

Imágenes de calcio de dos fotones in vivo que muestran el patrón espacial de las respuestas de las neuronas NTS a la distensión del estómago, la distensión del duodeno, la distensión del yeyuno y el agua laríngea.

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Ran, C., Boettcher, JC, Kaye, JA et al. Un mapa del tronco encefálico para las sensaciones viscerales. Naturaleza 609, 320–326 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05139-5

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Recibido: 25 Abril 2021

Aceptado: 25 julio 2022

Publicado: 31 de agosto de 2022

Fecha de emisión: 08 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05139-5

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